合作文章 | 从青贮到牛奶到餐桌，耐药基因如何"跨界旅行"？
文章题目：Hazardous risk of antibiotic resistance genes: Host occurrence, distribution,mobility and vertical transmission from different environments to corn silage
文章主题：抗生素抗性基因的危害风险：不同环境向玉米青贮的宿主赋存、分布、可移动性及垂直传递
研究团队：兰州大学郭旭生教授
组学技术：宏基因组测序+分箱
抗生素抗性基因（ARGs）作为一类新型环境污染物，已成为全球公共健康危机，若耐药问题持续恶化，预计到 2050 年每年可造成约千万人死亡；玉米青贮是反刍动物尤其是奶牛最主要的饲料来源，青贮依靠微生物发酵制备，不可避免携带耐药细菌与抗性基因，可沿着 “土壤‑玉米植株‑青贮‑畜禽‑动物产品‑人类” 的途径发生垂直传递，契合 “同一健康” 的防控理念。现有少量研究证实青贮中存在抗生素抗性基因，但大多只鉴定青贮内 ARGs 种类，忽略抗性基因的环境来源；同时不同气候会改变青贮原料附生微生物群落，而我国地域气候类型丰富，尚缺少系统解析不同气候区全株玉米青贮抗性组、ARGs 宿主、移动潜力及发酵过程动态变化的研究，因此有必要开展相关研究，评估青贮中 ARGs 带来的生物安全风险，为风险消减提供依据。
不同气候区玉米青贮的细菌群落及其演替
不同气候区的全株玉米青贮微生物群落组成存在差异。主成分分析结果表明，无论是发酵 5 d 还是 90 d，不同气候来源青贮的细菌群落均发生明显分群，其中西藏地区青贮的微生物群落与其他地区差异最为显著；基于宏基因组分箱的丰度前 20 物种分析发现，各气候区青贮均以乳酸菌为核心菌群，但优势乳酸菌物种存在地域差异，短 Levilactobacillus、Liquorilactobacillus hordei、植物乳植杆菌、清酒阔乳杆菌、耐酸乳杆菌分别在不同样本中占据优势，同时黑龙江、海南、山西发酵 90 d 的青贮中变栖克雷伯菌的相对丰度处于较高水平。
图1. 玉米青贮的细菌群落差异。
(A、B) 主成分分析（PCA），展示不同气候区发酵 5 d 和 90 d 青贮样品的细菌群落组成差异；(C) 不同气候区发酵 5 d、90 d 青贮中物种水平细菌的相对丰度（丰度前 20，宏基因组分箱分析结果）。
X：新疆；S：山西；H：黑龙江；G：贵州；T：西藏；K：海南；Y：甘肃。
不同气候区全株玉米青贮中的抗生素抗性基因（ARGs）与移动遗传元件（MGEs）
在全株玉米青贮中共检测到 98 个潜在耐药 ARGs，主要抗性机制为抗生素外排、灭活和靶点保护；主成分分析显示抗性基因组成存在显著的气候区差异，发酵 5 d 时山西、海南、西藏样本抗性基因组成区别于其他样品，发酵 90 d 后样本可划分为三类；除西藏、甘肃样品外，其余样本的 ARGs 相对数量随发酵显著降低，且除西藏青贮外，发酵提升了 ARGs 的 α 多样性；玉米青贮包含前噬菌体、基因组岛等多种移动遗传元件，除携带 ARGs 的质粒外，青贮发酵提高了其他类型 MGEs 的丰度。
图2. 发酵 5 d 和 90 d 青贮中抗生素抗性基因（ARGs）与移动遗传元件（MGEs）的组成。
(A、B) 主成分分析（PCA），反映不同气候区发酵 5 d、90 d 青贮样品的抗生素抗性基因组成差异；
(C、D) 不同气候区发酵 5 d、90 d 青贮中抗生素抗性基因的相对丰度（抗性基因数 / 检测总基因数）；
(E、F) 不同气候区发酵 5 d、90 d 青贮中抗生素抗性基因的多样性（Chao1 指数）；
(G) 热图，展示不同气候区发酵 5 d、90 d 青贮中移动遗传元件的丰度差异。
不同气候区玉米青贮的抗生素抗性基因（ARGs）组成
不同气候区玉米青贮的抗生素抗性基因组成特征，丰度前 20 的抗性基因存在区域差异，tetM、lnuA等基因的丰度随发酵显著降低；海南、山西、西藏青贮抗性基因种类约 15 种，发酵 5 d 与 90 d 的基因组成相近，发酵 90 d 黑龙江青贮抗性基因组成与上述三类样品相似；借助随机森林筛选出不同发酵阶段的标志性抗性基因，LEfSe 进一步明确了各区域样本中特异性富集的 ARGs；本研究共检出介导 17 类抗生素耐药的抗性基因，以四环素、环丙沙星、林可酰胺、磷霉素和 β‑内酰胺类为主，海南与山西青贮的耐药药物类别组成在发酵前后无明显变化，而黑龙江、贵州、新疆、甘肃青贮中四环素类和林可酰胺类抗性基因在发酵 5 d 时占比较高，发酵 90 d 后占比显著下降。
图3. 不同气候区青贮发酵早期（5 d）与后期（90 d）抗生素抗性基因（ARGs）相对丰度及对比。
(A) 丰度排名前 20 的抗生素抗性基因；
(B) 不同药物类别对应的抗性基因丰度；
(C、D) 发酵 5 d 和 90 d 玉米青贮的抗性机制；
(E、F) 基于随机森林分析得到的发酵 5 d、90 d 玉米青贮的标志性抗性基因。
环境因子与发酵特性对玉米青贮抗生素抗性基因（ARGs）的影响
利用 Mantel 检验分析环境因子对玉米青贮 ARGs 的影响，结果显示 ARGs 主要受到平均相对湿度、降水量、日照时长、平均最低温、最低相对湿度等温湿度相关气候因子调控；由于环境因子间存在复杂互作，选取平均温度与平均相对湿度开展结构方程模型（SEM）分析，提取微生物群落组成、有机酸、ARGs 组成的第一主成分用于建模，模型表明微生物群落组成、有机酸和平均温度共同解释 75% 的 ARGs 组成变异，有机酸、pH、平均相对湿度可通过微生物群落组成间接作用于抗性基因，微生物群落与有机酸是驱动青贮抗性基因分布的核心因素。
图4. 环境因子、发酵特性与微生物群落对抗生素抗性基因组成的影响。
(A) Mantel 检验用于分析有机酸、微生物群落与抗性基因之间的相关关系。实线箭头代表作用路径，效应显著（P＜0.05）；虚线箭头代表作用路径，效应不显著（P＞0.05）；箭头上的数字为标准化路径系数（经均值和标准差标准化）。(B) 基于玉米生长期气候因子、青贮发酵 pH 构建的结构方程模型，pH 为本模型的因变量。
不同气候区玉米青贮中可移动抗性基因及其宿主的鉴定
所有青贮样品中位于移动遗传元件上的 ARGs 占比为 25%–50%，贵州、黑龙江、新疆、甘肃青贮的质粒携带 ARGs 占比较高，随发酵时间延长，可移动 ARGs 占比逐步下降，海南、山西、西藏青贮的可移动抗性基因占比低于其他区域；属水平携带 ARGs 的微生物相对丰度介于 10.9%–88.5%，除海南样品外，发酵 90 d 携带 ARGs 微生物的丰度均低于发酵 5 d 样品；乳植杆菌属是青贮中携带可移动 ARGs 最普遍的菌属，其次为克雷伯菌属和阔乳杆菌属，不同区域样本抗性基因宿主存在明显差异，发酵 90 d 黑龙江、海南、山西青贮的可移动 ARGs 主要宿主为克雷伯菌属，而西藏青贮可移动 ARGs 主要由阔乳杆菌属携带。
图5. 不同气候区玉米青贮中的可移动抗性基因、抗性基因宿主及可移动抗性基因宿主。
(A) 宏基因组中可移动抗性基因占总抗性基因的比例；
(B) 抗性基因宿主的相对丰度；
(C) 可移动抗性基因宿主的相对丰度；
(D) 属水平上抗性基因、移动遗传元件与宿主的关联网络。
不同气候区全株玉米青贮中的高风险抗生素抗性基因（ARGs）
世界卫生组织（WHO）结合文献筛选出 73 种高风险抗生素抗性基因（其中 37 种由 WHO 提出）。本研究在中国不同气候区青贮样品中共检出 5 种高风险抗性基因：tetM、bacA、SHV‑1、dfrA17和QnrS1。tetM是检出率最高的高风险抗性基因，发酵过程降低了黑龙江（H）、贵州（G）、新疆（X）、甘肃（Y）青贮中该基因的相对丰度。bacA在所有样品的高风险抗性基因中均有较高检出，发酵 90 d 后，黑龙江、贵州、新疆、西藏（T）、甘肃青贮中bacA丰度上升，而海南（K）与山西（S）青贮中该基因丰度下降。SHV‑1存在于黑龙江、贵州、海南、山西、新疆青贮中，发酵 90 d 后的丰度高于发酵 5 d。dfrA17仅在发酵 5 d 的黑龙江青贮中检出；发酵 90 d 时，黑龙江、贵州、海南、山西、甘肃样品均可检测到dfrA17，其中 G90、Y90 样品的丰度最高。QnrS1在 H5 和 S5 样品中丰度较低，发酵 90 d 后，黑龙江与贵州青贮中QnrS1丰度升高。
图6. 不同气候区青贮发酵 5d与 90d样品中5种高风险抗生素抗性基因的相对丰度。
本研究利用宏基因组与分箱分析，表征取自不同气候区玉米在青贮发酵过程中的细菌群落组成与抗生素抗性基因（ARGs）特征。不同气候区样品的细菌群落与抗性基因存在差异，乳杆菌属（Lactobacillus）为所有区域中的优势菌属。抗性基因的差异与微生物群落组成、青贮发酵特性相关；西藏（Dwc）玉米青贮的抗性基因污染水平相对较低，这归因于该区域的气候与人为活动条件。值得注意的是，参与青贮发酵的多数细菌同时也是抗性基因宿主，只是其丰度在青贮发酵 90 d 后有所下降。因此，本研究提示青贮存在抗性基因相关的生物安全风险，呼吁更多关注青贮中的抗生素抗性基因、抗性基因宿主以及移动遗传元件，从而降低其对公共健康的潜在威胁。