项目文章 | 益生菌的新战场--多组学解析四联益生菌缓解自身免疫性肝炎的作用机制
文章标题：Multi-omics Analysis Reveals the Protection of a Quadruple Probiotic Mixture in Experimental Autoimmune Hepatitis
文章主题：多组学分析揭示四联益生菌混合物在自身免疫性肝炎中的保护作用
发表期刊：Probiotics and Antimicrobial Proteins
影响因子：5.3
组学技术：转录组、非靶代谢组、宏基因组
合作单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院刘梅教授团队
研 究 背 景 自身免疫性肝炎（AIH）是发病率不断升高的慢性进展性炎症性肝病，临床一线免疫抑制治疗存在疗效有限、全身副作用大的问题，亟待开发安全有效的干预手段；该病发病机制复杂，肠‑肝轴及肠道菌群紊乱在其发病中发挥重要作用，而复合益生菌相较单株益生菌具备更好的定植能力与健康获益，思连康（Probiotic‑quad）是国内获批临床应用多年的四联益生菌制剂，可改善肠道屏障、调节肠道菌群与机体免疫，但尚不清楚其对 AIH 是否具有保护作用，因此本研究借助多组学技术，在慢性 AIH 小鼠模型中探究该四联益生菌混合物的治疗效果，为 AIH 提供新的治疗思路。 研 究 思 路
研 究 结 果 四联益生菌制剂可减轻自身免疫性肝炎小鼠肝损伤与肝纤维化 本研究通过给小鼠转染人自身抗原细胞色素P450 2D6（CYP2D6）构建AIH慢性模型。在给药前，先完成四联益生菌的安全性评价：全基因组测序与毒力因子分析结果显示，制剂中的粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌无功能性毒力因子；蜡样芽孢杆菌未检出食源性致病菌株特有的呕吐毒素合成基因；动物体内实验同样证实这两株菌在小鼠体内使用安全，支持该益生菌复方用于动物干预实验。 肝组织H‑E染色结果：AIH模型小鼠肝细胞肿胀破裂，肝间质大量炎症细胞浸润；给予四联益生菌干预后，小鼠肝脏炎症浸润明显减轻，肝细胞肿胀缓解，肝组织结构破坏得到改善。血清生化检测显示，与 AIH 模型组相比，益生菌处理组小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平显著下降。天狼星红染色结果表明，四联益生菌干预能够缓解 AIH 小鼠的肝纤维化程度。综上，四联益生菌对实验性自身免疫性肝炎小鼠具有肝脏保护作用。 图1.益生菌联合疗法可减轻自身免疫性肝炎患者的肝损伤及肝纤维化病变 四联益生菌抑制 AIH 小鼠肝脏免疫过度活化 CD4⁺T 淋巴细胞介导的自身免疫是 AIH 关键致病机制，肝脏大量 CD4⁺T 浸润是 AIH 典型组织学特征。免疫组化结果可见，AIH 模型小鼠肝脏存在大量 CD4⁺T 淋巴细胞浸润；经四联益生菌干预后，肝脏 CD4⁺T 细胞浸润程度部分降低。 Th1、Th17、Treg 细胞参与调控自身免疫与肝脏炎症，是潜在治疗靶点。流式细胞检测结果：相较于正常对照组，AIH 小鼠肝脏 Th1、Th17 细胞比例升高；益生菌干预后，小鼠肝内 Th1、Th17 细胞比例显著下降，而肝内 Treg 细胞浸润无明显改变。血清 ELISA 检测结果显示，四联益生菌显著降低 AIH 小鼠血清促炎因子 TNF‑α、IFN‑γ、IL‑17A 的水平。以上结果提示，四联益生菌可调节 AIH 小鼠肝脏免疫应答。 图2.AIH小鼠经四联益生菌混合物治疗后免疫细胞谱分析 四联益生菌改善 AIH 小鼠肠道屏障完整性 肠道屏障受损会使脂多糖（LPS）等细菌产物入血，经门静脉抵达肝脏，加重肝脏炎症。本研究采用荧光示踪剂 FITC‑葡聚糖（FD4）评价肠道通透性：和对照组相比，AIH 模型小鼠血清 FD4 水平升高；益生菌干预后 FD4 水平显著下降，代表肠道通透性得到改善。AIH 小鼠血清 LPS 水平明显升高，益生菌处理后血清 LPS 浓度降低。 肠道组织免疫荧光与蛋白免疫印迹结果显示：AIH 小鼠肠道紧密连接蛋白 ZO‑1、Occludin 表达下调；四联益生菌干预后，ZO‑1 与 Occludin 蛋白表达部分恢复。以上结果证明四联益生菌可修复 AIH 小鼠肠道屏障功能。 图3.AIH 小鼠经益生菌治疗后肠道屏障完整性的变化 四联益生菌干预改变 AIH 小鼠肠道菌群组成 对盲肠内容物开展宏基因组测序，α 多样性（Chao1、ACE、Shannon、Simpson 指数）结果显示三组小鼠肠道菌群整体丰富度与多样性无显著差异；基于非度量多维尺度分析（NMDS）的 β 多样性分析显示，门水平、属水平上三组肠道菌群群落结构出现明显分离。 门水平：所有组优势菌群为厚壁菌门（Bacillota）、拟杆菌门（Bacteroidota）。与对照组相比，AIH 组厚壁菌门、蓝细菌门、Hofneiviricota 丰度升高，拟杆菌门、热脱硫杆菌门、疣微菌门丰度下降；AIH 组拟杆菌门/厚壁菌门比值由对照组0.65降至0.36；益生菌干预后该比值回升至0.41，Uroviricota、脱铁杆菌门、支原体门丰度显著上调。 属水平：AIH 组普雷沃氏菌、颤杆菌、Acetatifactor、Acutalibacter、真杆菌丰度上升；阿利斯泰普菌、Lepagella、阿克曼菌丰度下降；益生菌干预后阿利斯泰普菌丰度升高，Duncaniella、Acutalibacter丰度降低。 LEfSe 差异判别分析：对照组富集拟杆菌门、阿克曼菌、Lepagella；AIH 模型组富集厚壁菌门、Acutalibacter、Acetatifactor；益生菌干预组富集Uroviricota门，Dorea、Lachnoclostridum、Ruthenibacterium（短链脂肪酸产生菌）。基于KEGG的PICRUSt功能预测提示，益生菌干预组富集ATP结合盒转运体、转录因子、核糖体生物合成通路，提示益生菌提升AIH小鼠肠道菌群代谢活性。 图4.四联益生菌干预后 AIH 小鼠肠道菌群组成 四联益生菌干预后 AIH 小鼠肝脏代谢组学特征
肠道菌群与肝脏代谢存在肠‑肝轴交互作用，本研究开展肝脏非靶向代谢组。相较于AIH模型组，益生菌干预组共鉴定出139个代谢物上调、129个代谢物下调。显著上调代谢物包括4‑(甲硫基)‑2‑丁醇、氧化型谷胱甘肽、5‑甲氧基吲哚乙酸等；显著下调代谢物包括肌醇‑1,3‑二磷酸、海藻糖‑6‑磷酸等。KEGG富集提示差异代谢物主要富集于三羧酸（TCA）循环、色氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、胰高血糖素信号通路。
图5.AIH小鼠经益生菌四联疗法干预后的肝脏代谢组学特征分析 AIH 小鼠经四联益生菌处理后转录组通路变化
肝脏转录组主成分分析显示AIH组和益生菌干预组样本明显聚类分开，两组基因表达谱发生明显改变。KEGG 富集结果显示，益生菌干预显著影响细胞因子‑受体相互作用、趋化因子信号、抗原加工提呈、肠道IgA免疫网络，同时调控Th17、Th1、Th2细胞分化通路，与流式细胞结果互相印证。GSEA富集结果提示：NF‑κB信号通路、NOD样受体信号通路在益生菌干预后被显著抑制，这两条通路与AIH肝脏炎症密切相关。
图6.四联益生菌干预后AIH小鼠肝脏转录组通路分析 四联益生菌下调AIH小鼠NF‑κB与NOD样受体信号通路 Western Blot 结果显示，AIH 小鼠肝脏磷酸化 NF‑κB（p‑NF‑κB）蛋白水平升高；益生菌干预后 p‑NF‑κB 表达下降，NF‑κB 通路活化被抑制。肝脏免疫组化进一步验证：AIH 小鼠肝组织 p‑NF‑κB 高表达，益生菌处理后表达降低。 NOD 样受体通路关键蛋白 NLRP3、促炎因子 TNF‑α、IL‑1β 在 AIH 模型组肝脏高表达；四联益生菌干预后，NLRP3、TNF‑α、IL‑1β 蛋白表达均下调。以上结果提示四联益生菌可降低 AIH 小鼠肝脏 NF‑κB 与 NOD 样受体通路的激活水平。 图7.四联益生菌干预后AIH小鼠NF-κB、NOD样受体通路水平 结 论 与 意 义
该研究利用宏基因组、非靶向代谢组与转录组的多组学技术，在慢性自身免疫性肝炎小鼠模型中证实四联益生菌制剂能够改善肝功能，减轻肝脏炎症及纤维化，该保护效应与修复肠道上皮屏障、重塑肠道菌群组成、调控肝脏代谢、抑制 NF‑κB 和 NOD 样受体炎症信号通路密切相关，该多组学研究框架为自身免疫性肝炎开发基于肠道微生物的辅助治疗新策略提供实验依据，后续仍需开展粪菌移植、通路特异性抑制等实验进一步明确因果机制。
