文章题目：Metatranscriptomic insights into the effect of Lactiplantibacillus plantarum inoculation on fermentation metabolism, bacterial community function and antibiotic resistome of corn silage
文章主题：宏转录组解析植物乳杆菌接种对玉米青贮发酵代谢、细菌群落功能及抗生素抗性组的影响
发表期刊：Frontiers in Microbiology
研究团队：兰州大学许冬梅副教授
组学技术：宏转录组
乳酸菌接种剂被广泛应用于青贮生产，植物乳杆菌是其中最常用的菌种，已有研究证实它能够加速青贮酸化、减少蛋白水解、提升营养物质保存效果，但以往大多依靠 16S rRNA 扩增子或宏基因组技术，只能反映群落组成与功能遗传潜能，无法解析青贮全过程中微生物基因的实际转录表达动态；宏转录组可以捕捉活跃表达的基因，适合揭示发酵过程真实的功能响应。同时，在底物受限的青贮生境中，碳代谢与氮代谢存在潜在耦合关系，但植物乳杆菌接种是否会时序性调控青贮氮循环基因转录尚不明确。此外，青贮是农业环境抗生素抗性基因的重要储存库，现有对抗性组的研究多基于 DNA 层面的静态检测，尚不清楚接种植物乳杆菌是引入全新抗性基因，还是仅改变原有核心抗性组的表达模式，该研究因此利用宏转录组技术，探究植物乳杆菌接种对玉米青贮代谢时序变化、细菌群落功能以及抗生素抗性组转录动态的影响。
青贮时间、处理及其交互作用显著影响 pH、乙酸、LA/AA 比值与水溶性碳水化合物（WSC）。LP 组在两个时间点 pH 更低、WSC 更高；90 d 时乙酸显著低于对照组，LA/AA 比值上升，说明接种推动青贮后期向同型乳酸发酵转变。乳酸、丙酸、粗蛋白不受接种影响；丁酸随发酵时间增加。LP 组前期氨态氮更高，后期组间无差异；干物质、粗蛋白在各组无显著变化。
表1. 青贮过程中对照组与 LP 处理组青贮的发酵特性及化学成分
为明确接种处理对整体微生物群落结构的影响，分析了青贮微生物群落的 α、β 多样性，探究植物乳杆菌接种对菌群结构的影响。PCoA 与 PERMANOVA 结果表明，青贮微生物群落组成主要由发酵时间驱动，新鲜原料样本与发酵样本明显分离；在同一发酵时间点，经 FDR 校正后 LP 处理组与对照组群落整体无显著差异，PERMDISP 也证实两组样本组内离散程度无差别。发酵第 3 天时，LP 组和对照组在 PCoA 排序图上几乎重叠，Chao1、Shannon、Simpson 等 α 多样性指数组间均无显著差异；发酵至第 90 天，两组样本在 PCoA1 轴上排序位置出现分化，物种丰富度 Chao1 指数仍无明显差异，但 LP 组 Shannon 与 Simpson 多样性指数显著高于对照组，说明接种植物乳杆菌可在青贮后期提升群落多样性，但不会显著改变同一时期整体群落组成。
图1. 青贮过程中细菌群落的α多样性与β多样性动态变化。（A）主坐标分析（PCoA）；（B–D）α多样性指数，包括Chao1丰富度(B)、Shannon多样性指数(C)及Simpson多样性指数(D)。
图2. 细菌群落组成及 LEfSe 在种水平上的生物标志物分析。（A）物种组成柱状图；（B） LEfSe 在种水平上的生物标志物分析。
利用宏转录组数据开展 GO 与 KEGG 通路富集分析，探究接种植物乳杆菌对青贮微生物群落功能潜力的影响。GO 分析发现所有组均存在代谢、催化及转运活性等核心生物学过程；发酵第 90 天两组均可检测到细胞聚集、超分子纤维组装、生物膜形成相关功能条目，而细胞杀伤相关条目均低于检出限。KEGG 结果显示，第 90 天 LP 组碳水化合物代谢通路（糖酵解 / 糖异生、淀粉蔗糖代谢、磷酸转移酶系统）表达更高，与 LP 组水溶性碳水化合物保留更好的结果相呼应，其余多数功能类别两组表达水平相近。时间梯度的通路分析进一步揭示时序差异：发酵第 3 天 LP 组肽聚糖合成、β- 内酰胺抗性通路显著上调，丙酸代谢、内质网蛋白加工等复杂合成通路被抑制；发酵至第 90 天对照组自噬、凋亡等应激与降解通路显著富集，LP 组该类通路表达相对更低。
图3. 接种植物乳杆菌（LP）与对照组(C)青贮饲料之间差异 KEGG 通路富集分析。（A）KEGG热图；（B-E）富集气泡图。
利用宏转录组探究接种植物乳杆菌（LP）对青贮碳代谢及相关功能基因表达的影响。全基因组差异表达分析显示 LP 组上调基因数量远多于下调基因，第 3 天 1024 个上调、82 个下调，第 90 天 665 个上调、72 个下调。第 3 天 LP 组核心碳代谢、氨基酸合成、乙酸生成、氮与氧化还原代谢相关基因上调，ackA、fbp、eno、pfkA上调倍数超过 30 倍；胁迫耐受与细胞表面合成相关基因在 LP 组高表达。至第 90 天，LP 组仍有 44 个基因上调、3 个下调，碳代谢相关通路维持较高转录水平；mdh、nirK、gpmI在 LP 组的表达水平由早期上调转为低于对照组。CAZyme 分析表明，LP 组 CAZyme 家族丰度在第 3 天与 90 天无显著时序变化，功能更稳定；对照组 56.4% 的 CAZyme 家族随发酵时间显著改变，两个时间点 LP 组与对照组的 CAZyme 家族丰度无组间差异。CAZyme 谱主要表征微生物对可溶性碳水化合物的利用潜力，而非木质纤维素降解。综上，LP 接种能够快速激活并稳定维持青贮微生物核心碳代谢相关通路，提升发酵代谢稳定性。
图4. 接种植物乳杆菌后核心碳代谢及相关功能基因的差异表达。气泡图展示经 TPM 标准化后，参与核心碳代谢及其相关通路的选定基因转录本丰度。(A) 在整个发酵阶段，植物乳杆菌接种组（LP）青贮中表达量更高的代表性基因。(B) 第 3 天时 LP 组相对对照组显著上调的基因。(C) 第 3 天时 LP 组相对对照组显著下调的基因。(D) 第 90 天时 LP 组相对对照组显著上调的基因。(E) 第 90 天时 LP 组相对对照组显著下调的基因。气泡大小代表转录本平均丰度（TPM），颜色深浅表示表达水平高低。
基于宏转录组分析 LP 接种对青贮氮代谢基因表达的影响，两个时间点 LP 组与对照组氮循环基因转录丰度均存在差异。发酵第 3 天 LP 组多条氮转化通路基因整体上调，反硝化基因（nirK、nirS、nosZ）、DNRA 与硝酸盐还原相关基因（nirD、nirB、narJ、napC）以及氮获取同化基因（nifH、nifW、glnA、gdh、nmo）表达均高于对照组。到第 90 天，组间差异缩小，仅nirA、glsA在LP组显著高表达；早期差异明显的多数反硝化与 DNRA 基因组间差异减弱，但nosZ、nirS仍在LP组维持较高转录水平。结果说明 LP 可在发酵早期广泛激活氮转化相关基因，后期仅保留部分关键氮代谢基因的高表达。
图 5 氮代谢相关基因的转录谱。气泡图展示经 TPM 标准化后的氮相关基因转录本丰度，这些基因在 LP 处理组青贮中相比对照组显著上调。(A) 第 3 天 LP 组相对对照组显著上调的基因。(B) 第 90 天 LP 组相对对照组显著上调的基因。气泡大小与颜色代表转录本平均丰度（TPM）。
通过宏转录组分析探究了植物乳杆菌（LP）接种及发酵时间对玉米青贮抗生素抗性基因表达谱与抗性组结构的影响，结果表明青贮抗性组的整体演替主要由发酵时间驱动，LP接种并非主导因素。发酵第3天LP组与对照组ARG组成高度相似、组间差异较小，发酵90 d后两组抗性结构发生明显分化；青贮优势抗性基因为tet(C)、APH(3’)-Ia、bacA和tet(M)，随着发酵进行，对照组出现tet(C)极端富集、氨基糖苷类基因大幅下降的特征，而LP处理可有效均衡抗性基因分布，维持较高的氨基糖苷类、多药外排及肽类抗性基因表达水平，避免单一四环素抗性基因过度累积。大环内酯-林可酰胺-链阳菌素及多药外排相关抗性基因在整个发酵期低表达且随发酵持续降低。药物类别水平的转录模式与单个基因丰度特征并不完全匹配，且各组、各时间点检出的抗性类别保守稳定，发酵过程未出现新型抗性基因，LP接种也未造成青贮活性抗性组扩增、未增加抗生素抗性传播风险。
图6. 青贮过程中的抗生素抗性基因（ARG）图谱。(A) 主坐标分析（PCoA）。(B) 不同处理与时间点下优势 ARG（前 20 个）的相对丰度，包含新鲜原料（FM）、对照组（C）和 LP 处理组青贮。堆叠柱状图代表各类抗生素抗性基因的相对占比。(C) LEfSe 分析筛选不同发酵阶段与处理组特异性 ARG 生物标志物（LDA 分值＞4.0）。(D) 新鲜样品中不同药物类别 ARG 的表达量（TPM）。
综上，接种植物乳杆菌（LP）可改善玉米青贮发酵，促使发酵趋于同型乳酸发酵特征；发酵第 90 天青贮 pH 更低、乙酸含量下降，乳酸/乙酸比值更高。上述发酵特征的改变与优势菌群组成相关，LP 处理组青贮中耐酸类群丰度更高，且碳水化合物代谢相关基因的表达水平持续高于对照组青贮。但解读本研究结果时需考虑若干局限性：本试验仅采用单一玉米品种与一株植物乳杆菌，每个取样时间点下各处理设置 3 个生物学重复；此外，宏转录组结果未通过 RT-qPCR、代谢组学或酶活测定等其他方法进行验证。因此，本研究结论仅适用于本试验设定的条件。后续研究可纳入更多饲草种类、接种菌株以及田间规模化青贮体系，进一步佐证本研究结果，并加深对青贮生态系统中抗生素抗性基因动态变化的认识。
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