成功案例 | snRNA‑seq解析马铃薯热胁迫响应！挖掘核心耐热基因StPIF4
文章标题：Transcription Profiling of Potato Leaves in Response to Heat Stress at Single-Cell Resolution
文章主题：马铃薯叶片在热胁迫下的单细胞转录组学分析
发表期刊：Plant Biotechnology Journal
影响因子：12.8
组学技术：snRNA-seq、bulk RNA-seq
研究背景 马铃薯作为全球重要粮食作物，热胁迫严重抑制其生长与块茎发育，制约产业可持续发展；尽管植物热响应相关通路、ROS 清除系统已有较多研究，但马铃薯热适应的细胞层面机制尚不清晰，且 StPIF4 在马铃薯热胁迫中的功能未被解析；传统原生质体单细胞测序易产生表达假象，单细胞核测序技术虽可规避该缺陷，但尚未用于马铃薯叶片热胁迫研究，模式植物的研究结论也不能直接套用，因此本研究利用 snRNA‑seq 构建马铃薯叶片常温及热胁迫下的单细胞转录图谱，解析不同细胞类型的热应答机制并挖掘验证核心耐热基因，填补该领域研究空白。 研究思路 ①样本收集：选取马铃薯双单倍体 DM 1‑3516 R44 为试验材料，分别设置常温对照组（22℃白天/18℃夜晚）与热胁迫处理组（35℃白天/28℃夜晚，24h），收集叶片组织提取细胞核用于单细胞核测序；同时选取Atlantic、E‑potato3品种构建StPIF4过表达、RNAi干扰转基因株系，野生型作为对照，用于高温胁迫表型与生理分子验证实验； ②实验检测：对常温、热胁迫两组叶片细胞核开展 snRNA‑seq 单细胞核转录组测序，同时配套Bulk RNA‑seq 转录组测序；后续通过RNA荧光原位杂交验证细胞标记基因空间位置；借助 GUS 染色、qRT‑PCR、双荧光素酶报告实验、EMSA 凝胶迁移实验验证基因调控关系；高温处理后测定 Fv/Fm、离子渗漏率、MDA、抗氧化酶活性以及ROS、细胞死亡染色等耐热相关生理指标； ③生信分析：整合单细胞核转录组与转录组数据，开展细胞降维聚类、细胞类型注释、细胞类型差异基因分析、拟时序分析、共表达网络分析，对比常温与热胁迫条件下各细胞类型转录应答差异，解析StPIF4‑StHSFA2耐热调控模块的调控关系； ④机制解析：综合单细胞核‑批量转录多层组学与转基因功能验证结果，构建“高温信号感知‑表皮等多细胞类型转录重编程‑StPIF4激活‑StHSFA2热激通路启动-ROS清除增强‑耐热性提升”的调控模型，阐明马铃薯叶片热胁迫响应的细胞异质性及StPIF4耐热的分子机制，为马铃薯耐热育种筛选潜在靶点。 研究结果 马铃薯叶片细胞图谱的构建
本研究以常温（CK，22 ℃/18 ℃）与热胁迫（35 ℃/28 ℃，24 h）处理的马铃薯叶片为材料开展单细胞核转录组测序，一共获得77344个高质量细胞核，其中对照组42673个，热胁迫组34671个；样本生物学重复相关性高，测序质量可靠。通过降维聚类得到21个细胞核簇，成功注释出6种主要细胞类型：表皮细胞、保卫细胞、叶肉细胞、原基细胞、增殖细胞、维管细胞。
图1.马铃薯叶片单细胞转录组测序图谱 马铃薯叶片中主要细胞类型的鉴定
利用scPlant数据库、跨物种已知细胞Marker完成细胞亚群注释；筛选得到1696个马铃薯叶片全新细胞特异性标记基因；不同细胞类型的GO功能富集结果存在明显差异：表皮细胞富集脂肪酸代谢、角质合成通路；保卫细胞富集乙烯信号、硫胺素合成（气孔调控）通路；叶肉细胞富集光合作用通路；原基/增殖细胞富集细胞周期通路；维管细胞富集激素转运通路。RNA荧光原位杂交实验验证了FAMA、SBT5.3、IMK2、KNAT3标记基因的空间表达位置，证明细胞分型结果准确。
图2.马铃薯叶片中细胞类型的鉴定 马铃薯中新型叶细胞类型特异性标记基因的特征分析
各细胞簇差异基因统计结果显示，表皮细胞响应热胁迫最为强烈，差异基因数目最多。热胁迫在表皮、叶肉、维管细胞诱导82个胁迫响应、氮代谢、光合作用相关基因上调；不同细胞类型拥有各自特异的热响应基因集，证明马铃薯叶片细胞对高温的应答存在显著细胞异质性。
图3.马铃薯中新型叶细胞类型特异性标志基因 热胁迫促进叶片细胞沿伪时间轨迹分化
拟时序分析将所有细胞核划分为5种发育状态：State2为发育起点，富集原基细胞、增殖细胞；State1 以叶肉细胞为主；State3、State5富集维管细胞；State4由表皮细胞+保卫细胞构成；轨迹上存在2处细胞分化分支节点；维管细胞位于过渡分支位置，参与细胞命运调控，在热响应中起到重要作用。
图4.CK组与热胁迫马铃薯幼苗叶片中细胞间的拟时序分析 不同细胞簇差异基因以及细胞分化相关差异转录因子
高温不会改变马铃薯叶片细胞发育的主干轨迹，但显著改变成熟/未成熟细胞的比例。热胁迫处理后表皮细胞、叶肉细胞、保卫细胞占比上升，原基细胞、增殖细胞比例下降，说明高温推动分生性质的细胞加速分化为成熟的功能细胞。后续从全部细胞簇中共鉴定427个热胁迫差异转录因子。
图5.不同细胞群及细胞分化过程中的差异表达基因（DEGs） 单细胞分辨率下马铃薯叶片热胁迫转录共表达网络
通过整合单细胞核与RNA‑se数据构建马铃薯叶片热胁迫共表达网络，鉴定出12个核心热响应转录因子，其中StPIF4为关键候选基因；双荧光素酶实验证实StERF5、StRL1、StKUA1、StWRKY40可激活各自下游靶基因的启动子，同时验证StPIF4能够直接激活StNPY1‑1与StCCoAOMT的启动子，证明预测的转录因子‑靶基因调控关系真实可靠，为解析马铃薯热胁迫的转录调控机制提供重要依据。
图6.马铃薯叶片在单细胞分辨率下响应热胁迫的转录共表达网络 StPIF4增强马铃薯在热胁迫下的热耐受性
GUS 染色结果显示高温能够激活StPIF4的启动子；42℃热胁迫处理表型观察发现StPIF4过表达马铃薯株系耐热性增强，RNAi干扰株系耐热性减弱；生理指标检测表明StPIF4过表达株系离子渗漏率与MDA含量更低、Fv/Fm值更高，DAB、NBT、台盼蓝染色显示其ROS积累和细胞死亡程度更轻，同时POD、SOD、CAT 抗氧化酶活性显著上升，而RNAi株系呈现相反的生理表型，证实StPIF4通过提高活性氧清除能力缓解高温引发的氧化损伤，正向调控马铃薯的耐热性。
图7. StPIF4可增强马铃薯在热胁迫条件下的热耐受性 结论与意义
本研究利用单细胞核RNA测序（snRNA‑seq）组学技术构建了马铃薯叶片热胁迫的单细胞转录图谱，鉴定出6类叶片主要细胞类型与细胞特异性标记基因，解析不同细胞类型对热胁迫的差异化响应，结合拟时序分析揭示高温会促进马铃薯分生细胞向成熟功能细胞分化，并通过共表达网络筛选得到核心转录因子StPIF4；经过转基因功能验证表明StPIF4可通过提升活性氧清除能力增强马铃薯耐热性，该研究从细胞分辨率层面阐明马铃薯热适应的分子机制，为马铃薯耐热种质创新与分子育种提供宝贵的组学资源与基因靶点。