成功案例 | ATAC-seq联合 CUT&Tag揭示绵羊支原体肺炎抗性新机制，锁定关键基因FOXF1
文章标题：Epigenetic analysis of sheep mycoplasma pneumonia and the effect of FOXF1 on Mycoplasma ovipneumoniae infection
文章主题：绵羊支原体肺炎的表观遗传学分析及FOXF1对支原体肺炎感染的影响
发表期刊：Virulence
影响因子：6.8
组学技术：ATAC-seq、CUT&Tag、RNA-seq
绵羊支原体肺炎由绵羊肺炎支原体（MO）引发，是全球高发、高传染性的绵羊呼吸道传染病，会造成病羊咳嗽、肺部实变、生长停滞甚至死亡，还危害藏羚羊、大角羊等野生反刍动物，严重制约养羊产业可持续发展；当前依靠药物与疫苗的防控模式存在药物残留、病原菌耐药性加剧等弊端，抗病育种成为核心替代思路，但现有绵羊抗该病研究多仅从基因组或转录组单一维度筛选候选基因，缺乏多组学联合解析表观遗传调控机制，且缺少肺泡上皮细胞层面的关键抗病基因功能体外验证体系，同时FOXF1作为已知调控肺发育与肺损伤修复的转录因子，其在绵羊抵抗MO感染中的作用尚无相关报道，本研究以此为切入点，整合表观组、转录组与GWAS数据挖掘绵羊抗支原体肺炎关键基因并开展细胞功能验证，填补相关研究空白。
①样本收集：选取健康湖羊以及患有支原体肺炎的患病湖羊获取肺组织样本，并且收集7日龄健康羔羊的肺组织用于分离原代肺泡上皮细胞，同时参考相关公共数据集补充测序资料；
②实验检测：对新鲜的肺组织样本开展ATAC‑Seq、H3K4me3、H3K27ac CUT&Tag表观组测序，后续利用细胞样本完成支原体感染干预实验，留存组织样本用于后续的分子原位检测；
③生信分析：整合表观组测序数据和前期转录组、GWAS数据，开展细胞/基因注释，对比患病个体与健康个体之间的染色质、基因表达分子差异，筛选出和绵羊支原体肺炎抗性有关的候选基因FOXF1；
④体内‑体外验证：培养绵羊原代肺泡上皮细胞开展FOXF1过表达与敲低体外细胞功能试验，之后借助支原体感染动物模型，验证FOXF1基因在抵御绵羊肺炎支原体感染当中的作用机制。
图1. 绵羊肺炎支原体抗性表型鉴定与实验设计
表观基因组测序数据概览
ATAC-Seq、H3K4me3 CUT&Tag 与 H3K27ac CUT&Tag 三类测序的插入片段长度均符合预期，样本基因组比对率均高于94.88%，数据质量可靠；样本相关性分析显示三类表观组学数据间呈强正相关，与转录组数据相关性较弱。全基因组峰分布显示三类活性调控标记的信号均富集于转录起始位点（TSS）上下游3 kb区域；患病组TSS附近 H3K4me3 与 H3K27ac 富集信号显著高于健康组，且患病组启动子区的 H3K27ac、H3K4me3 峰数量占比低于健康组。
图2. 表观遗传学数据概述
差异表观调控区域鉴定
通过健康组与患病组的组间差异分析，ATAC-Seq 共鉴定出 358 个上调、609 个下调的差异染色质开放区域（DAR）；H3K4me3 CUT&Tag 鉴定出 894 个上调、1249 个下调的差异组蛋白修饰区域（DMH）；H3K27ac CUT&Tag 鉴定出 2049 个上调、2782 个下调的差异组蛋白修饰区域，整体呈现下调的表观调控区域数量更多的特征。
图3. 健康组与疾病组间差异性表观遗传区域的鉴定
多组学整合分析鉴定抗病候选基因 FOXF1
将三类表观组的下调关联基因、转录组下调差异基因与 GWAS 关联基因取交集，共得到 120 个在健康组中转录活性更高的共有基因；功能富集显示这些基因富集于 DNA 结合转录因子活性、免疫应答、血管生成及 Ras 信号通路、细胞黏附分子等通路。其中 FOXF1 同时属于 GWAS 关联基因，且在健康组中呈现染色质开放度更高、H3K4me3 与 H3K27ac 修饰更强、基因表达量更高的特征；基序分析显示健康组高开放染色质区域显著富集 FOXF1 转录因子结合基序，最终锁定 FOXF1 为绵羊抗支原体肺炎的核心候选基因。
图4. 多组学综合分析鉴定出FOXF1为绵羊MP的候选基因
敲低FOXF1表达增强绵羊肺泡上皮细胞对MO感染的易感性
通过梯度MOI预实验确定30 MOI感染2 h为最优攻毒条件；两条靶向 FOXF1 的 siRNA 均可高效敲低肺泡上皮细胞中FOXF1的表达，敲低效率超90%。FOXF1 敲低后进行 MO 攻毒，细胞内 MO 载量显著升高、活菌浓度更高，同时细胞中凋亡执行因子 caspase 3 与凋亡启动因子 caspase 8 活性显著上调，细胞存活率显著下降，说明抑制 FOXF1 会加重 MO 对肺泡上皮细胞的黏附与损伤效应。
图5. 敲低FOXF1表达可使绵羊肺泡上皮细胞对钼（Mo）感染更为敏感
过表达 FOXF1 降低绵羊肺泡上皮细胞对 MO 的易感性
通过梯度滴定确定腺病毒过表达载体的最优转染剂量，qRT-PCR验证显示FOXF1过表达效率可达对照组的8倍。FOXF1过表达后进行MO攻毒，细胞内MO载量较对照组下降77%，活菌浓度显著降低，caspase 3与caspase 8活性受到抑制，肺泡上皮细胞存活率显著提升，证实FOXF1过表达可减轻MO诱导的细胞损伤，发挥抗感染保护作用。
图6. FOXF1的过表达可降低绵羊肺泡上皮细胞对钼（Mo）的易感性
本研究整合 ATAC-Seq、H3K4me3 与 H3K27ac CUT&Tag 表观组测序技术，联合转录组分析与全基因组关联研究（GWAS）的多组学策略，系统解析了健康与支原体肺炎患病绵羊肺组织的表观调控差异，鉴定并通过细胞实验验证了 FOXF1 是绵羊抵御绵羊肺炎支原体感染的关键抗病基因，证实健康绵羊肺组织中 FOXF1 基因内含子区的启动子与增强子元件可通过表观激活上调其转录表达，进而抑制支原体对肺泡上皮细胞的黏附定植、减轻感染诱导的细胞凋亡，发挥抗支原体肺炎的保护作用；该研究不仅揭示了绵羊支原体肺炎抗性的表观遗传调控新机制，也丰富了绵羊抗肺炎育种的基因资源库，为绵羊支原体肺炎的抗病分子选育与靶向防控研究提供了重要的理论依据与遗传靶点。