项目文章 | 多组学+基因动物验证：AhR-NQO1 轴介导菌群抗骨质疏松作用
文章题目：The Metabolite indole-3-acetic acid of Bacteroides ovatus ameliorates ovariectomyinduced bone loss by activating AhR and inhibiting oxidative stress
文章主题：肠道卵形拟杆菌分泌的吲哚- 3 -乙酸，能够激活 AhR 通路、减轻氧化损伤，减缓绝经后雌激素缺乏造成的骨质流失
发表期刊：Free Radical Biology and Medicine
影响因子：8.0
组学技术：16S rRNA+宏基因组测序+非靶代谢组+靶向代谢组+转录组
研究团队：首都医科大学宣武医院鲁世保主任医师、陈小龙副主任医师
研究背景
绝经后骨质疏松症是一种由雌激素缺乏驱动的全身性骨骼代谢疾病，其核心病理特征为骨吸收超过骨形成，现有临床药物虽能部分延缓骨丢失，但常伴随显著副作用和依从性差等问题，亟需发掘安全有效的新型干预策略。近年来，“肠-骨轴”概念的兴起重塑了骨骼稳态的调控认知，肠道菌群及其代谢产物已被证实可通过调节免疫应答、内分泌信号及肠道屏障功能深度影响骨代谢；其中，卵形拟杆菌（Bacteroides ovatus）作为新一代益生菌候选菌株，在调节肠道免疫和炎症反应中展现出潜力，但其在骨骼系统中的具体作用尚属空白。值得注意的是，色氨酸代谢途径中的吲哚-3-乙酸（IAA）作为卵形拟杆菌的关键代谢产物，已被确认为芳香烃受体（AhR）的有效配体，而氧化应激已被证实在雌激素缺乏状态下是驱动破骨细胞过度分化的关键放大信号。然而，卵形拟杆菌及其代谢物IAA是否通过激活AhR抑制氧化应激从而缓解绝经后骨丢失，其内在的分子机制仍有待系统阐明，这也是本研究致力解决的核心科学问题。
研究思路
研究结果
卵形拟杆菌在绝经后女性及去卵巢诱导骨质疏松小鼠体内丰度降低
为探究肠道菌群改变与绝经后骨质疏松之间的关联，基于两套绝经后女性肠道宏基因组公共数据集完成质控过滤，通过 α、β 多样性分析发现骨质疏松女性菌群丰富度显著降低、三组人群整体菌群群落无差异但物种组成区分明显，再结合 WGCNA 与 RFE、Boruta、LASSO 三种机器学习算法共同筛选出卵形拟杆菌、加氏乳杆菌等 4 种关键菌种，其中卵形拟杆菌在骨质疏松患者体内显著耗竭；随后利用小鼠宏基因组测序验证，去卵巢骨质疏松小鼠同样存在肠道菌群紊乱且卵形拟杆菌丰度明显下降，结合 μCT 骨检测与相关性分析证实卵形拟杆菌丰度与骨量、骨小梁结构指标显著相关，最终得出卵形拟杆菌丰度降低与雌激素缺乏诱导的骨丢失密切相关的结论。
图1. 骨质疏松动物模型中菌群组成改变、卵形拟杆菌丰度下降
(A) 三种机器学习算法筛选得到的与绝经后骨质疏松相关核心菌群；
(B) 基于辛普森指数的 α 多样性分析，对比假手术组小鼠（n=8）与去卵巢（OVX）小鼠（n=8）肠道菌群差异；
(C) 主成分分析（PCA）表征 β 多样性结果（n=8）；
(D、E) 宏基因组测序分析假手术小鼠与 OVX 小鼠门水平细菌相对丰度（仅展示丰度前 30 的门类，每组 n=8）；
(F、G) 宏基因组测序分析假手术小鼠与 OVX 小鼠属水平细菌相对丰度（仅展示丰度前 30 的菌属，每组 n=8）；
(H) 宏基因组测序菌群差异火山图：蓝色代表丰度下调菌种，红色代表丰度上调菌种（每组 n=8）；
(I) 骨小梁显微 CT（μCT）典型图像及三维重建图；
(J、K) 骨小梁三维微结构定量分析指标：骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）（n=8）；
(L) 宏基因组测得的卵形拟杆菌丰度与骨体积分数（BV/TV）的皮尔逊相关性分析。
活菌卵形拟杆菌可缓解去卵巢诱导的骨丢失
本研究进一步探究口服卵形拟杆菌对去卵巢诱导骨丢失的干预效果。通过设置假手术组、OVX 模型组、活菌卵形拟杆菌（LBO）干预组、热灭活卵形拟杆菌（KBO）干预组开展对照动物实验，μCT、骨组织染色与血清骨标志物检测结果显示仅活菌 LBO 能够显著改善 OVX 小鼠骨小梁微结构，提升骨密度、骨体积分数等骨量相关指标，减少破骨细胞数量、增加成骨细胞并提高骨矿化沉积速率，恢复骨重塑平衡；抗生素清除小鼠自身肠道菌群后，LBO 的护骨效应大幅减弱，说明卵形拟杆菌需依赖肠道菌群共生环境才能发挥缓解雌激素缺乏性骨丢失的作用，热灭活菌体则无显著护骨功效。
图2. 口服活菌卵形拟杆菌（LBO）可缓解去卵巢（OVX）小鼠的骨丢失
(A) 骨小梁显微 CT 典型图像及三维重建图（比例尺 = 1 毫米）。
(B–F) 骨小梁三维微结构定量分析指标，包括骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、骨小梁数量（Tb.N），每组样本量 n=8。
(G) 股骨远端 TRAP 免疫组化染色代表性图片（比例尺 = 50 微米）。
(H) 股骨远端骨钙素（OCN）免疫组化染色代表性图片（比例尺 = 50 微米）。
(I–K) 单位骨面积破骨细胞数（N.Oc/BS）、单位骨面积破骨细胞占比（Oc.S/BS）、单位骨面积成骨细胞数（N.Ob/BS）的定量统计，每组 n=8。
(L) 血清骨钙素（OCN）含量检测，n=8。
(M) 血清 I 型胶原 C 端肽（CTX-1）含量检测，n=8。
(N) 钙黄绿素双标荧光染色典型图像（比例尺 = 50 微米）。
(O) 骨小梁矿化沉积速率（MAR）定量分析，n=8。
活菌卵形拟杆菌可改善去卵巢小鼠的肠道屏障功能
围绕活菌卵形拟杆菌对去卵巢小鼠肠道屏障的保护作用开展实验，结果显示 OVX 模型小鼠肠道屏障受损，血清内毒素 LPS 水平显著升高；口服活菌 LBO 可显著降低血清 LPS 浓度，H&E 切片可见肠道炎症损伤减轻，AB-PAS 染色证实 LBO 能提升杯状细胞数量、增厚肠道黏液层，同时免疫组化、qPCR 及 Western blot 结果均表明 LBO 可上调紧密连接蛋白 Occludin、ZO-1、Claudin-1 的表达，而热灭活 KBO 无上述修复效果，说明具备生物活性的卵形拟杆菌能够修复雌激素缺乏引发的肠道黏膜破损、降低机体低度内毒素血症。
图3. 口服活菌卵形拟杆菌（LBO）改善去卵巢（OVX）小鼠肠道黏膜通透性
(A) ELISA 法检测各组小鼠血清脂多糖（LPS）浓度（n=8）。
(B、C) 结肠组织 H&E 染色代表性图像及组织学评分；评分依据结肠黏膜上皮细胞变性坏死、肠腔炎性渗出、固有层炎症细胞浸润程度判定（比例尺 = 50 μm，n=8）。
(D) AB-PAS 染色镜下图像（比例尺 = 50 μm）。
(E、F) AB-PAS 染色定量分析：相对杯状细胞数量、相对黏液层厚度（n=8）。
(G、I) 结肠 Occludin 蛋白免疫组化染色代表性图像及表达水平定量统计（比例尺 = 50 μm）。
(H、J) 结肠 ZO-1 蛋白免疫组化染色代表性图像及表达水平定量统计（比例尺 = 50 μm）。
(K) 结肠组织 ZO-1、Occludin、Claudin-1 的相对 mRNA 表达水平（n=6）。
(L–N) Western blot 检测结肠组织 ZO-1、Claudin-1 蛋白表达，采用 ImageJ 软件进行灰度定量分析（n=3）。
卵形拟杆菌来源的吲哚- 3 -乙酸（IAA）缓解去卵巢诱导的骨丢失
通过体外菌液代谢组筛选锁定卵形拟杆菌特征代谢产物吲哚- 3 -乙酸（IAA）；动物层面开展 IAA 口服回补实验，μCT、骨组织染色、血清骨转换标志物检测结果证实 IAA 能够显著改善 OVX 小鼠骨小梁微结构紊乱，抑制破骨细胞过度活化、改善骨重塑失衡；同时 IAA 干预可修复 OVX 小鼠受损的肠道屏障，降低血清 LPS 水平；相关性分析显示小鼠粪便与血清 IAA 含量和骨量指标呈正相关，证明卵形拟杆菌主要依靠分泌代谢物 IAA 发挥护骨作用。
图4. 卵形拟杆菌源性 IAA 对去卵巢（OVX）小鼠发挥有益保护作用
(A) 卵形拟杆菌培养液上清与空白 BHI 培养基非靶向代谢组分析热图（n=6）。
(B) 非靶向代谢组图谱火山图；红色代表上调代谢物，蓝色代表下调代谢物（n=6）。
(C) 小鼠粪便样本色氨酸靶向代谢组检测结果（n=8）。
(D) 血清 IAA 浓度检测（n=6）。
(E) 粪便 IAA 相对含量与骨体积分数（BV/TV）的皮尔逊相关性分析。
(F) 骨小梁显微 CT 典型图像及三维重建图（比例尺 = 1 mm）。
(G–I) 骨小梁三维微结构定量分析指标：骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）（n=8）。
(J) 股骨远端 TRAP 染色与 OCN 染色代表性图像。
(K、L) 单位骨面积破骨细胞数（N.Oc/BS）、单位骨面积成骨细胞数（N.Ob/BS）定量统计（n=8）。
(M) 骨组织活性氧（ROS）荧光染色代表性图像（比例尺 = 50 μm）。
(N) AB-PAS 染色镜下图像（比例尺 = 100 μm）。
IAA 通过抑制 RANKL 诱导的 NF-κB 通路，阻碍破骨细胞分化与骨吸收
体外细胞实验探究 IAA 调控破骨细胞的分子机制，采用 RANKL 诱导骨髓巨噬细胞建立破骨分化模型；TRAP 染色、骨吸收陷窝实验证实 IAA 能够以浓度依赖性方式显著抑制破骨细胞形成与骨吸收功能；qPCR 结果显示 IAA下调破骨相关特异性基因表达；进一步机制研究表明，IAA 可阻断RANKL介导的NF-κB 信号通路活化，抑制 IκBα 磷酸降解以及 p65 入核，由此减弱下游破骨分化相关转录程序，最终抑制破骨细胞分化与骨吸收活性。
图5. IAA 抑制破骨细胞分化与骨吸收
(A) 不同浓度 IAA 干预下破骨细胞诱导培养的 TRAP 染色代表性图像（比例尺 = 200 μm）。
(B) TRAP 阳性多核细胞（细胞核＞3 个）定量统计（n=5）。
(C) 体外实验显示 IAA 抑制破骨细胞 F - 肌动蛋白环形成的代表性图像；红色标记 F - 肌动蛋白，蓝色标记细胞核（比例尺 = 200 μm）。
(D) F - 肌动蛋白染色定量分析（n=5）。
(E) 扫描电镜下牛骨片骨吸收陷窝代表性图像；细胞经 50 ng/mL RANKL 诱导，同时给予或不给予 15～60 μM IAA 处理，培养 7 天（比例尺 = 50 μm）。
(F) 骨片吸收面积定量分析（n=5）。
(G–J) 梯度浓度 IAA 处理后，采用 qPCR 检测 Nfatc1、Mmp9、c-Fos、Ctsk 的 mRNA 相对表达水平，以 β-actin 作为内参（n=5）。
(K–O) 梯度浓度 IAA 干预后，Western blot 检测破骨特异性基因蛋白表达水平，并对条带灰度进行定量分析（n=5）。
图6. IAA 抑制 RANKL 诱导的 NF-κB 通路活化
(A) 对照组与 IAA 处理组差异表达基因火山图。红色代表显著下调基因，蓝色代表显著上调基因；共筛选得到 21 个上调基因、509 个下调基因（n=3）。
(B) KEGG 富集分析展示骨髓巨噬细胞（BMMs）经 IAA 刺激后发生显著变化的信号通路。
(C) 热图展示在破骨细胞分化、NF-κB 信号通路以及氧化应激反应相关通路中，经 IAA 处理后表达下调的基因（n=3）。
(D–G) Western blot 检测 RANKL 诱导的 NF-κB 信号通路中 p65 与 IκBα 的磷酸化水平，并进行灰度定量、组间比较（n=5）。
IAA 通过激活芳香烃受体介导的氧化应激通路抑制破骨细胞分化
已有文献表明色氨酸代谢物能够结合 PXR、AhR 等核受体发挥生物学功能。为阐明 IAA 抑制破骨细胞分化的具体下游分子通路，首先利用转录组测序筛选 IAA 作用下发生显著变化的核受体；随后借助免疫共沉淀实验验证 IAA 与候选受体之间是否存在直接相互作用；在此基础上，进一步通过抑制剂干预实验，明确 AhR 是否介导 IAA 对破骨细胞分化的调控效应，解析IAA–AhR信号轴在破骨生成过程中的功能地位。结果表明：IAA 可作为内源性配体激活 AhR 信号通路，AhR 是介导 IAA 抑制破骨细胞分化不可或缺的关键靶点。
图7. IAA 通过激活 AhR 抑制破骨细胞分化
(A、B) 采用携带 AhR shRNA 的慢病毒或对照慢病毒感染骨髓来源巨噬细胞（BMMs），给予 RANKL 刺激培养 5 天；设置添加或不添加 60 μM IAA 处理，随后进行 TRAP 染色并定量分析。细胞核≥3 个的 TRAP 阳性细胞判定为破骨细胞（n=5）（比例尺 = 200 μm）。
(C、D) 骨髓来源巨噬细胞处理方式同 A、B，采用鬼笔环肽染色显示 F - 肌动蛋白；设置添加或不添加 60 μM IAA 处理并开展定量分析（n=5）（比例尺 = 200 μm）。
(E、F) 将骨髓来源巨噬细胞接种于牛骨基质片，利用重组小鼠 M-CSF（30 ng/mL）与 RANKL（50 ng/mL）诱导破骨细胞分化；待破骨细胞成熟后加入 60 μM IAA 继续培养 4～5 天。通过扫描电镜结合 ImageJ 软件分析评估骨吸收活性（n=5）（比例尺 = 50 μm）。
(G–I) 按照上述实验流程处理细胞，采用蛋白质免疫印迹检测并定量破骨细胞标志物蛋白表达水平（n=5）。
(J、K) 检测并定量细胞内活性氧（ROS）水平。
(L、M) JC-1 染色检测线粒体膜电位，对 JC-1 聚集体与单体荧光强度进行定量统计（n=3）（比例尺 = 50 μm）。
(N、O) 采用 MitoSOX 荧光染色检测线粒体活性氧蓄积水平并定量分析（n=5）（比例尺 = 100 μm）。
(P–R) 骨髓来源巨噬细胞按上述方式处理，Western blot 检测抗氧化活性氧相关标志物蛋白表达并定量（n=5）。
图8. IAA 通过激活 AhR 并上调 NQO1 表达抑制破骨细胞分化
(A–C) 使用过表达 AhR 慢病毒（over-AhR）感染骨髓来源巨噬细胞（BMMs），加入 M-CSF 与 RANKL 共同培养 5 天；采用蛋白质免疫印迹检测并定量抗氧化活性氧标志物蛋白表达水平（n=5）。
(D、E) 将骨髓来源巨噬细胞分别感染对照慢病毒、过表达 AhR 慢病毒、过表达 AhR+ES936 慢病毒，在 M-CSF 与 RANKL 条件下培养 5 天；设置 / 不加入 60 μM IAA 干预后进行 TRAP 染色并定量分析（比例尺 = 200 μm，n=5）。
(F、G) 如 A、B 所述，利用鬼笔环肽染色显示 F - 肌动蛋白，随后开展定量分析（比例尺 = 200 μm，n=5）。
(H、I) 将骨髓来源巨噬细胞接种于牛骨基质片，在 M-CSF 与 RANKL 体系培养 5 天；待破骨细胞成熟后加入 60 μM IAA 继续培养 4～5 天，通过扫描电镜结合 ImageJ 软件分析评估骨吸收活性（比例尺 = 50 μm，n=5）。
(J–L) 采用蛋白质免疫印迹检测并定量破骨细胞标志物蛋白表达水平（n=5）。
(M、N) 检测并定量细胞内活性氧（ROS）水平（n=5）。
(O、P) 采用 JC-1 荧光探针检测线粒体膜电位（比例尺 = 50 μm，n=5）。
(Q、R) 借助 MitoSOX 荧光染色检测线粒体活性氧蓄积水平并定量统计（比例尺 = 100 μm，n=5）。
体内阻断 AhR 会削弱卵形拟杆菌与 IAA 的骨保护作用
体内功能补救实验明确证实，AhR是卵形拟杆菌及其代谢产物IAA发挥骨保护与肠道屏障修复作用的必需核心靶点。阻断AhR信号通路可完全逆转LBO与IAA对OVX小鼠的抗骨质疏松效应，从动物水平验证了卵形拟杆菌通过分泌IAA、激活AhR信号通路，抑制破骨分化、修复肠道屏障、改善雌激素缺乏性骨丢失的完整作用机制。
图9. AhR 敲低小鼠中，卵形拟杆菌与 IAA 对 OVX 诱导骨质疏松的保护效应消失
(A) 在 AhR 敲低小鼠中灌胃给予卵形拟杆菌的实验方案示意图。
(B) 骨小梁显微 CT 代表性图像及三维重建图（比例尺 = 1 mm）。
(C–E) 骨小梁微结构三维参数定量分析，包括骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁分离度（Tb.Sp）（n=5）。
(F) 股骨远端 TRAP 染色与 OCN 染色代表性图像（比例尺 = 50 μm）。
(G、H) 破骨细胞数 / 骨表面（N.Oc/BS）、成骨细胞数 / 骨表面（N.Ob/BS）定量统计（n=5）。
(I) 在 AhR 敲低小鼠中灌胃给予 IAA 的实验方案示意图。
(J) 骨小梁显微 CT 代表性图像及三维重建图（比例尺 = 1 mm）。
(K–M) 骨小梁微结构三维参数定量分析，包括骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）（n=5）。
(N) 股骨远端 TRAP 染色与 OCN 染色代表性图像（比例尺 = 50 μm）。
(O、P) 破骨细胞数 / 骨表面（N.Oc/BS）、成骨细胞数 / 骨表面（N.Ob/BS）定量统计（n=5）。
研究结论
综上所述，多组学联合分析结果表明，卵形拟杆菌及其色氨酸源性代谢产物吲哚- 3 -乙酸（IAA）在去卵巢（OVX）小鼠体内显著减少。口服卵形拟杆菌（LBO）或 IAA 均可有效改善雌激素缺乏引发的骨丢失。随着肠道 - 骨轴相关研究不断深入，靶向肠道菌群已成为骨质疏松极具前景的治疗策略。本研究为菌群 - 宿主互作调控骨骼稳态提供了有力的机制证据，并为绝经后骨质疏松开辟了基于肠道菌群的全新治疗思路。