成功案例 | 单细胞核转录组+空间转录组，解锁中枢免疫细胞的空间异质性
文章标题：Microglial dysregulation and spatiotemporal dynamics of inflammation in multiple sclerosis white matter: an integrative transcriptomic analysis
文章主题：多发性硬化症白质中小胶质细胞功能失调与炎症的时空动态变化研究
发表期刊：Journal of Translational Medicine
影响因子：9.7
组学技术：单细胞核转录组、空间转录组
多发性硬化（MS）是以中枢神经系统白质脱髓鞘、轴突损伤为核心特征的自身免疫性疾病，小胶质细胞作为病灶内关键固有免疫细胞，其表型异常活化是驱动局部炎症与组织破坏的重要因素；现有研究多局限于稳态/促炎二元极化模型，缺乏从单细胞转录调控、细胞动态分化轨迹结合组织空间微环境的多维度解析，小胶质细胞稳态失衡的核心转录开关、病灶不同区域炎症异质性的形成机制尚不明确，因此本研究借助单细胞核转录组联合空间转录组技术，聚焦小胶质细胞转录调控网络，探索介导白质炎症损伤的关键分子，为MS病理机制与潜在治疗靶点提供理论依据。 ①样本收集：纳入79例多发性硬化患者与13例对照白质组织样本，获取单细胞核转录组数据，搭配空间转录组解析组织微环境空间特征，并整合独立公共数据集用于结果重复验证； ②实验检测：脑组织开展snRNA-seq测序，依托空间转录组技术解析病灶区域空间分布特征； ③生信分析：整合多组学测序数据，完成细胞分群注释，借助pySCENIC构建基因调控网络、CellChat开展细胞通讯分析，结合伪时序轨迹解析小胶质细胞动态分化过程，对比MS与对照组细胞、分子通路差异，挖掘关键调控转录因子IKZF1； ④机制解析：联合单细胞动态演化规律与空间分区特征，阐明IKZF1调控小胶质细胞向促炎DAM样表型转化介导白质损伤的分子机制，构建完整疾病调控模型。 多发性硬化与对照白质存在异质性细胞组成
本研究整合79例MS患者和13例对照的白质单细胞核转录组数据，质控过滤后得到335694个细胞核，注释出少突胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞等8种主要细胞类型；对比两组细胞丰度发现，MS白质星形胶质细胞数量增多、少突胶质细胞减少，神经血管细胞比例无明显差异。
MS白质基因调控网络存在模块特异性紊乱
利用pySCENIC算法构建包含406个转录调控因子的基因调控网络，聚类划分出14个调控模块，其中模块M3在MS小胶质细胞中的调控子活性评分显著低于对照组，该模块富集趋化因子、MAPK等多条炎症相关信号通路；GSEA分析显示MS小胶质细胞内炎症应答、IFN-γ应答、TNFα/NFκB等促炎通路显著激活。
图2.转录调控网络的构建与差异模块识别 IKZF1是介导小胶质多条核心炎症通路的关键转录因子
针对小胶质细胞炎症应答、IL2-STAT5信号、IFN-γ应答三条关键通路开展转录因子富集分析，IKZF1、SPI1、FLI1等多个转录因子被显著富集，其中IKZF1同时参与三条促炎通路的调控，GSEA验证三条通路在MS小胶质细胞中上调显著。通过转录因子富集散点图、通路富集曲线、转录因子-靶基因互作网络，明确IKZF1在小胶质炎症激活中的核心调控地位。
图3.炎症相关信号通路的关键转录调控子 IKZF1调控子特异性表达于小胶质细胞，其活性下调伴随线粒体功能损伤
JSD细胞特异性分析证实IKZF1调控子几乎仅特异性存在于小胶质细胞，MS患者小胶质细胞的IKZF1基因表达水平、调控子活性均显著低于健康对照，该结果在公共数据集得到重复验证；IKZF1低活性的小胶质细胞与免疫细胞均富集氧化磷酸化、线粒体电子传递链等线粒体损伤相关通路，结合细胞分群UMAP、表达活性箱线图、GO生物学过程富集条形图呈现IKZF1的细胞特异性及下游功能紊乱。
图4.IKZF1调控子的细胞特异性及功能关联 IKZF1低活性小胶质细胞在MS白质中发生异常细胞通讯
采用CellChat工具解析细胞间配体-受体互作，MS组织中IKZF1低活性小胶质细胞的整体通讯强度远高于对照组，这类小胶质细胞主要与星形胶质细胞发生异常互作，核心通路为SPP1-(ITGAV+ITGB1)，同时通过PSAP-GPR37通路增强与少突胶质细胞的交流。
图5.KZF1低评分小胶质细胞的通讯模式改变 小胶质细胞处于动态稳态状态
对40137个小胶质细胞重新亚聚类，划分出应激型、稳态型、促炎DAM样、吞噬型、修复型5个亚群，MS与对照组均包含全部亚型；其中Micro3促炎亚群DAM特征评分最高，高表达血管调控、缺氧相关基因，各亚群拥有各自独特的功能富集通路，推翻传统简单M1/M2极化模型。
图6.小胶质细胞的异质性亚群划分 小胶质拟时序分化过程中IKZF1调控活性逐步下降
CytoTRACE2算法显示应激型Micro1分化潜能最高，被定义为小胶质分化轨迹的起点，Monocle构建的伪时序轨迹表明促炎Micro3、修复Micro5是疾病相关终末分化状态；伴随细胞向病理状态分化，IKZF1基因表达和调控子活性持续显著降低，高DAM评分的Micro3差异基因富集脂质代谢、炎症调控通路。
图7.小胶质细胞的拟时序轨迹与IKZF1动态 多发性硬化症白质损伤的空间异质性
空间转录组将脑组织划分为灰质、正常白质、斑块周边白质、病灶边缘LR、病灶核心LC、血管浸润6类微环境，LR区域小胶质细胞丰度最高，LC病灶核心富集星形胶质细胞形成胶质瘢痕；整体上对照组IKZF1调控活性高于MS组织，且MS内部LR区域的IKZF1表达与调控活性显著高于LC核心区。
图8.白质损伤的空间异质性与IKZF1空间分布 疾病相关的小胶质细胞在病变边缘富集
基于经典DAM特征基因对组织切片打分后发现，DAM高分区域与病灶边缘LR高度重合，LR内DAM高评分区域的电子传递链、氧化磷酸化、铁代谢、脂质代谢等6条DAM标志性通路活性显著高于低分区域，使用MS特异性MIMS特征集重复分析得到一致结果。
图9.疾病相关小胶质细胞（DAM）在病灶边缘富集 整合多组学结果构建 MS 白质损伤调控概念模型
综合单细胞转录组、拟时序轨迹、细胞通讯、空间转录组全部数据构建机制模型：IKZF1调控子活性下降会驱动小胶质向促炎DAM样表型转化，引发线粒体损伤、促炎因子大量释放，促进外周免疫细胞穿透血脑屏障浸润，病灶边缘LR作为核心炎症微环境持续放大炎症反应，最终诱发MS白质脱髓鞘与轴突损伤。
图10.MS 白质损伤调控概念模型 本研究借助单细胞核转录组与空间转录组技术系统解析多发性硬化白质病灶微环境，证实转录因子IKZF1活性下调能够驱动小胶质细胞向促炎DAM样亚型转化，引发线粒体功能紊乱、异常细胞通讯及局部炎症放大，且病灶边缘区域是炎症富集的核心空间位点；该研究从分子、细胞、空间多层面揭示了MS白质损伤全新调控机制，打破传统小胶质细胞M1/M2二元极化认知，明确IKZF1作为调控小胶质病理活化的关键分子靶点，为理解中枢脱髓鞘病变空间异质性以及开发多发性硬化新型免疫干预策略提供重要理论基础。