项目文章 | ITS扩增子测序揭示：芽囊原虫感染如何重塑高原牦牛肠道真菌群落
文章标题：Association of Intestinal Fungal Dysbiosis Related to blastocystis sp. in Yaks on Plateau
文章主题：高原牦牛肠道真菌失调与芽囊原虫相关的关联研究
发表期刊：Pakistan Veterinary Journal
影响因子：5.4
研究团队：西藏农牧科学院畜牧兽医研究所单曲拉姆团队
组学技术：ITS
百易汇能为本研究提供了ITS 扩增子 Illumina MiSeq 上机测序服务。
研究背景
芽囊原虫是一种广泛流行的人畜共患肠道寄生原虫，可经口传播并造成宿主肠道炎症与腹泻；牦牛是青藏高原牧区核心经济家畜，当地牦牛芽囊原虫感染率居高不下，严重影响其生产性能，而肠道真菌群落与宿主肠道稳态密切相关，已有研究证实多种肠道原虫会造成宿主肠道菌群紊乱，但目前还缺少高原牦牛芽囊原虫感染与肠道真菌菌群变化的相关研究，因此本研究利用真菌 ITS 扩增子测序技术对比感染阳性与健康阴性牦牛的肠道真菌群落，解析芽囊原虫感染诱发的真菌失调特征，为该病的防控提供微生物学理论依据。
研究路线
研究结果
1. 测序数据概述
本研究一共收集12份牦牛粪便样本，分为芽囊原虫感染阳性组（BSP组，n=6）与未感染阴性对照组（CON组，n=6）。真菌ITS扩增子测序结果显示，阳性组获得2021402条原始读段，阴性对照组获得2702263条原始读段；经过质控过滤后，两组有效读段数量分别为1973301条和2625224条。所有样本的稀释曲线均趋于平缓，Good’s Coverage指数接近1，说明测序深度充足，能够覆盖样本中绝大多数真菌物种。本研究共获得1621个真菌ASV，韦恩图结果显示两组共有348个共享ASV，其余ASV为各组特有物种。
图2.不同群体中牦牛的维恩图及α多样性分析
2. 肠道真菌α多样性分析
物种丰富度结果显示，Chao1、ACE指数以及观测物种数在BSP组与CON组之间无统计学差异（P>0.05）。而真菌群落均匀度指标存在显著组间差异：芽囊原虫阳性感染组的Pielou均匀度指数（P＜0.01）、Shannon多样性指数（P＜0.01）与Simpson指数（P＜0.05）均显著低于健康对照组。上述结果表明，芽囊原虫感染不会改变牦牛肠道真菌的物种总数，但会显著降低真菌群落的均匀度，造成整体菌群多样性下降。
图3.α多样性分析
3. 肠道真菌群落组成分析
门水平结果显示，两组牦牛肠道的优势真菌门保持一致，主要为子囊菌门、担子菌门与新美鞭菌门。其中子囊菌门在BSP组占比48.80%，CON组占比45.53%；担子菌门在两组占比分别为38.86%和37.69%；新美鞭菌门在感染组丰度（12.23%）低于健康组（16.44%）。
纲、目、科水平的群落结构出现明显分化：BSP组以银耳纲、锤舌菌纲为主，优势目为丝孢酵母目与锤舌菌目；CON组优势类群为座囊菌纲，格孢菌目与孢霉目占主导地位。
在属分类水平，Naganishia在芽囊原虫感染组丰度高达51.46%，远高于对照组的21.28%，为感染组的优势菌属；而健康对照组中Preussia、Sporormiella等纤维降解真菌丰度显著更高。GraPhlAn物种进化树直观展示了两组真菌群落的物种构成差异。
图4.群落组成分析
4. β多样性与群落结构差异分析
基于Bray-Curtis距离开展的主成分分析（PCA）、主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度分析（NMDS）结果显示：BSP组与CON组样本能够各自聚集、相互分离。ANOSIM组间差异性检验结果P＜0.01，UPGMA聚类树也证实两组真菌群落结构存在极显著差异，证明芽囊原虫感染能够重塑牦牛肠道真菌整体群落结构。
图5.β多样性分析
5. 组间差异真菌物种筛选
差异检验共筛选出36个具有统计学差异的真菌属。在芽囊原虫阳性感染组中，Naganishia、曲霉属、毛霉属、念珠菌属、Wallemia等条件致病性真菌显著富集；而健康对照组中，参与粗纤维降解的Preussia、Sporormiella、Coniochaeta以及厌氧真菌Anaeromyces丰度显著上调。
6. 真菌群落功能预测
真菌属相关性网络表明，有益纤维降解真菌与条件致病真菌之间存在明显的负向竞争抑制关系。基于PICRUSt2对真菌代谢通路进行预测，一共得到19条组间差异显著的MetaCyc代谢通路。其中芽囊原虫感染组仅上调6条代谢通路；健康对照组有13条通路显著上调，主要包含糖酵解、硫酸盐同化、乙醛酸循环等碳水化合物与物质能量代谢通路。该结果说明，芽囊原虫感染会抑制牦牛肠道真菌的营养代谢功能，降低宿主对牧草粗纤维的消化利用能力。
图6.真菌网络构建及功能预测
结论与意义
本研究通过真菌 ITS 扩增子测序证实，高原牦牛芽囊原虫感染可引发肠道真菌菌群紊乱，在不改变真菌物种丰富度的前提下显著降低群落均匀度，极大改变肠道真菌整体群落结构；感染会造成曲霉、念珠菌等条件致病真菌大量富集，同时使Coniochaeta、厌氧真菌等纤维降解有益菌丰度下降，进而抑制碳水代谢相关通路，削弱牦牛对牧草的消化能力；本研究筛选得到一系列真菌分子标志物，不仅阐明了芽囊原虫通过扰乱肠道真菌稳态损害宿主生产性能的潜在机制，还为青藏高原牦牛芽囊原虫病的流行病学防控、益生菌制剂开发提供了重要的微生物组实验依据，同时提示携带病原的牦牛存在较高的人畜共患传播风险。
文章关键词：ITS 测序，真菌高通量测序，牦牛肠道真菌组，芽囊原虫，微生物组测序，肠道微生态，MiSeq 测序，真菌菌群紊乱