成功案例 | meRIP多组学为房颤相关纤维化提供新治疗靶点
文章标题：Runx1 N6-methyladenosine methylation enhances cytoskeleton remodelling and boosts cardiac fibrosis
文章主题：Runx1基因的N6-甲基腺苷甲基化可促进细胞骨架重塑并加剧心脏纤维化
发表期刊：Cardiovascular Research
影响因子：13.3
组学技术：meRIP、ChIP-seq、RNA-seq、scRNA-seq
研究背景
心脏纤维化是房颤等心血管疾病的关键病理改变，由心脏成纤维细胞活化、细胞外基质过度沉积导致，但现有治疗效果有限。Runx1作为转录因子，参与心脏发育与疾病，但m⁶A（N6-甲基腺苷）表观转录组修饰对Runx1的调控及其在纤维化中的作用尚不明确。m⁶A是mRNA最丰富的内部修饰，YTHDF1为关键读取蛋白，可调控mRNA翻译与稳定性。本研究旨在揭示m⁶A-YTHDF1-Runx1通路在心脏纤维化中的作用及机制，为疾病治疗提供新靶点。
研究路线
研究结果
1. Runx1在房颤患者及实验性心肌纤维化模型中表达升高
为探究房颤相关心肌纤维化的潜在机制，本研究对窦性心律与房颤患者心房组织开展RNA测序，差异基因火山图显示房颤心房组织大量mRNA表达紊乱。为验证纤维化模型中Runx1表达变化，本研究分析异丙肾上腺素（ISO）诱导心肌损伤模型的公共RNA测序数据集（GSE82294），结果显示ISO处理小鼠心脏Runx1 mRNA水平较对照组显著升高；压力负荷诱导纤维化（TAC）模型的整合数据集（GSE252607、GSE210983）也得到一致结论，Runx1表达明显上调。GSEA富集分析显示，Runx1高表达组显著富集胶原纤维组装通路。公共数据集GSE115574测序结果显示，相较于窦性心律人群，房颤患者心房组织Runx1、COL1A1表达升高。组织免疫荧光实验证实，房颤患者心房组织中Runx1与POSTN共定位，且Runx1表达升高伴随POSTN上调。
上述结果提示Runx1在心肌纤维化与房颤进程中发挥关键作用。
图2. Runx1在人类心房颤动及实验性心脏纤维化模型中表达水平升高
2. 成纤维细胞特异性敲低Runx1可缓解实验性心肌纤维化
对TAC小鼠心脏单细胞RNA测序（GSE155882）数据进行分析：tSNE分群图显示Runx1主要表达于巨噬细胞，但TAC组与假手术组巨噬细胞Runx1表达无显著差异。聚焦心肌成纤维细胞（CF）亚群：TAC组成纤维细胞Runx1、Postn、Col1a1表达显著上调；拟时序分析显示，随成纤维细胞活化进程，Runx1表达逐步升高，与纤维化标志物Postn、Col1a1上调趋势同步。Spearman相关性分析显示，成纤维细胞中Runx1表达与Postn、Col1a1呈显著正相关；对Runx1共表达前100个基因开展GO、KEGG富集，结果显著富集细胞外基质组装、TGF-β信号通路。免疫荧光共染验证Runx1空间分布：ISO、TAC模型小鼠心室组织、房颤患者心房组织中，Runx1与成纤维细胞标志物POSTN存在大量共定位，提示Runx1特异性在活化心肌成纤维细胞中升高。关键基因敲低显示：与对照组相比，AAV9-Postn-shRunx1组Runx1表达显著降低，同时COL1A1、POSTN表达下调。染色显示，成纤维细胞特异性Runx1敲除小鼠胶原沉积显著减少、纤维化程度减轻。超声心动图检测显示，Runx1敲除小鼠心功能显著改善。
图3. 成纤维细胞特异性清除Runx1可改善实验性心脏纤维化
3. Runx1促进CTGF转录激活，参与房颤相关纤维化重构
体外TGF-β1刺激人、小鼠原代心肌成纤维细胞后，Runx1、COL1A1、POSTN表达上调；qPCR与Western Blot验证该变化。ChIP-seq与ChIP-qPCR证明Runx1能够结合Ctgf基因启动子区域；双荧光素酶报告实验证实Runx1可增强Ctgf启动子转录活性。敲低Runx1会降低CTGF表达、抑制成纤维细胞增殖。免疫荧光可见细胞内POSTN、CTGF表达减少。F-肌动蛋白荧光染色显示，敲低Ctgf会抑制细胞应力纤维生成，过表达Ctgf则促进细胞骨架重构。CTGF过表达可逆转Runx1敲低引发的骨架损伤。Runx1过表达成纤维细胞转录组富集胶原合成通路，蛋白检测证实胶原表达升高。氯化钙-乙酰胆碱诱导房颤小鼠心房成纤维细胞中Runx1、Ctgf及纤维化标志物表达均上升。
图4. Runx1可增强Ctgf的转录激活并促进心脏成纤维细胞增殖
4. Runx1的表达上调由N6-甲基腺苷（m⁶A）甲基化修饰介导
对ISO模型小鼠心脏进行MeRIP-seq，联合RNA测序筛选出56个m⁶A修饰存在显著差异的基因，这类基因主要参与细胞外基质与胶原合成，Runx1是其中差异显著的基因。IGV可视化显示Runx1转录本存在关键m⁶A修饰峰Peak_21317。MeRIP-qPCR证实ISO小鼠心肌、TGF-β1处理的成纤维细胞中，该位点m⁶A甲基化水平显著升高，且该修饰位点在人和小鼠序列中保守。纤维化模型心肌及活化成纤维细胞内m⁶A甲基转移酶表达升高，整体m⁶A水平上升。采用m⁶A抑制剂DAA处理成纤维细胞，细胞整体m⁶A水平下降，Runx1、CTGF、纤维化标志物表达降低，细胞增殖能力减弱，应力纤维形成受阻；反之，过表达Runx1能够促进细胞骨架组装。
图5. Runx1在体内和体外均因m6A甲基化而表达上调
5. Runx1的m⁶A修饰依赖YTHDF1发挥调控作用
TGF-β1刺激仅上调m⁶A阅读蛋白YTHDF1，而非YTHDF2/3。敲低YTHDF1可下调Runx1表达，抑制成纤维细胞增殖与活化标志物表达。RNA衰减实验证明YTHDF1缺失会降低Runx1 mRNA稳定性；RIP实验证实TGF-β1刺激增强YTHDF1与Runx1 mRNA的结合能力。m⁶A抑制剂处理会降低Runx1 mRNA稳定性。
对Peak_21317位点进行点突变（MUT1、MUT2），突变后该区域m⁶A修饰水平大幅下降。转染突变型Runx1质粒后，细胞Runx1、Ctgf mRNA与蛋白表达降低，成纤维细胞增殖受抑。YTHDF1敲低对突变型Runx1的抑制效果明显减弱，突变后Runx1 mRNA稳定性不再受YTHDF1调控。双荧光素酶实验显示，敲低YTHDF1仅抑制野生型Runx1报告基因活性，突变体无明显变化；RIP实验证实位点突变后YTHDF1与Runx1的结合显著减少。多聚核糖体分析证明YTHDF1缺失会降低Runx1翻译效率。
图6. Runx1的表达受m6A修饰以YTHDF1依赖性方式调控
6. 表观转录层面抑制Runx1可缓解实验性心肌纤维化
本研究构建成纤维细胞特异性YTHDF1条件敲除小鼠（cKO-Ythdf1），建立ISO、TAC纤维化模型。蛋白检测显示cKO小鼠心肌Runx1、CTGF、POSTN表达显著低于野生型小鼠。
敲除YTHDF1后，小鼠心肌胶原沉积减少，心脏收缩功能显著改善；心室组织免疫荧光显示cKO组Runx1、POSTN荧光信号减弱。在cKO小鼠成纤维细胞中通过AAV9过表达Runx1进行挽救实验：Runx1、CTGF、POSTN表达恢复，心功能损伤重新出现，细胞骨架结构也得到部分修复。ChIP-qPCR证实Runx1可结合Ctgf启动子；敲除YTHDF1会减弱Runx1在Ctgf启动子的富集，过表达Runx1可逆转该现象。
图7. Runx1的表观转录组抑制可改善实验性心脏纤维化
结论与意义
本研究结合RNA-seq、scRNA-seq与MeRIP-seq多组学技术，在房颤患者样本与心肌纤维化动物模型中证实m⁶A阅读蛋白YTHDF1通过识别Runx1 mRNA上保守的甲基化修饰位点，增强Runx1翻译效率，上调的Runx1进一步转录激活下游CTGF基因，最终促进心肌成纤维细胞增殖与骨架重构，加剧心肌纤维化。体内成纤维细胞特异性敲除YTHDF1能够显著抑制Runx1表达、减轻胶原沉积并改善心功能，而过表达Runx1可逆转该保护效应。该研究完整阐明了m⁶A表观修饰调控房颤心肌重塑的分子通路，为房颤合并心肌纤维化提供了新的分子靶点与治疗思路。
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