在动手操作之前，理解类器官与常规样本的差异，有助于您精准规避潜在风险：

• 基质胶（Matrigel）的包裹与残留：常规细胞系或解离组织多为游离单细胞或小块，而类器官通常深埋在基质胶中。基质胶不仅增加了物理分离的难度，残留的胶体成分还可能抑制后续酶解效率或干扰建库反应。因此，需根据下游方案明确是保留基质胶一并处理，还是去除后再进行解离。

• 三维结构导致的解离挑战：类器官内部细胞间连接致密，且较大尺寸的类器官中央可能因缺氧而形成坏死核心。相较于脾脏、血液等易解离的组织，类器官需要更加温和而高效的酶解策略，既要充分打散细胞簇，又要避免过度消化引发“解离应激”（dissociation stress）——即应激基因（如 FOS、JUN）的异常上调，影响转录组真实性。

• 细胞组成因来源而异，需区别看待：对于成体干细胞（ASC）来源的上皮类器官（如肠道、胃、肝），其细胞类型确实相对单一，主要为上皮谱系，缺乏实体肿瘤组织中丰富的免疫细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞。而多能干细胞（PSC）来源的类器官（如脑、肾）则包含神经、间质等多谱系，组成更为复杂。但无论在哪种情况，单细胞测序均能有效捕获类器官内部的发育轨迹、干细胞分化状态及亚群异质性——在成分相对简单的上皮类器官中，这一优势尤为突出，低丰度信号更容易被解析。

类器官的细胞得率受其生长状态、大小及基质胶包裹程度影响，因此“足量提供”是核心原则。

• 悬液类样本（已解离）：建议提供细胞数量大于 2×10⁶ cells。

• 类器官沉淀（离心收集）：若类器官已离心收集，沉淀物体积建议达到黄豆大小（大于0.2g）。

• 包裹于基质胶中的类器官：提供培养皿中至少 80% 汇合度的孔板（例如6孔板中3~4个孔的胶滴总量）

• 预实验建议：不同来源、不同传代次数的类器官对解离酶的耐受性差异显著。若样本极为珍稀，建议提前取少量类器官进行预实验，确定最佳解离条件（酶种类、浓度、时间）及预期活细胞得率，避免正式实验时样本耗竭。

根据您后续的实验安排，类器官样本主要分为“新鲜寄送”与“冻存寄送”两种路径，请严格按照以下规范操作：

新鲜样本能最大程度保留细胞的原生转录组状态。

1. 培养基包裹：请使用类器官的完全培养基进行重悬和保存，切勿使用PBS或其他非等渗缓冲液。

2. 基质胶处理：若类器官仍包裹在基质胶中，可随基质胶一起放入保存液中寄送，无需强行剥离，以免损伤细胞。

3. 温度控制：全程维持 2℃~8℃ 低温环境（使用冰袋），使细胞处于低代谢状态，防止细胞裂解或过度增殖。

若无法及时寄送新鲜样本，规范的冻存是最佳选择。

1. 去除培养基：冻存前，请尽量去除类器官表面的残留培养基。

2. 耐低温耗材：必须使用耐低温的螺纹口冻存管，普通离心管在液氮或干冰环境下极易破裂漏液。

3. 速冻与保存：去除培养的类器官组织液氮速冻，-80℃保存，短期保存不超过1个月；长期保存请务必转入液氮罐。运输时需液氮速冻后，使用干冰寄送。

样本在途中的环境稳定性直接关系到RNA的完整性，请遵循以下打包与物流规范：

1. 防漏与标识：冻存管管壁请使用油性记号笔清晰标记样本编号与日期。管口使用封口膜密封，并装入自封袋中，防止运输途中漏液。

2. 保温与缓冲：

• 选择厚度大于3cm的优质泡沫箱。

• 新鲜样本需放入足量冰袋，但务必使用气泡膜或棉垫将样本管与冰袋隔开，防止局部温度过低导致样本冻结死亡。

• 干冰寄送时，请根据运输天数动态计算干冰用量（建议：运输天数 × 5kg/天）。

3. 时效要求：新鲜样本在保存液中的运输总时间严格控制在48小时以内。

4. 随附文件：箱内请务必附上《样本信息单》，确保样本与信息的精准对应。