项目文章 | 0.5%假阳性阈值下的精准“钓”菌：三组学揭示潘多拉菌的环丙沙星转化与应激响应
文章题目：Activity-guided discovery of antibiotic-transforming bacteria from environmental microbiomes using D-amino acid–assisted fluorescence-activated cell sorting
文章主题：借助 D - 氨基酸辅助荧光流式分选技术，活性导向筛选环境微生物组中可转化抗生素的功能细菌
发表期刊：Environmental Pollution
研究团队：安徽医科大学朱婷婷老师
组学技术：细菌基因组+转录组+代谢组
百易汇能为本研究提供了全基因组测序服务。
在环境生物修复研究中，从复杂环境微生物组里高效获取具备污染物转化功能的活性微生物一直是核心难题：能够降解抗生素的功能微生物往往丰度极低、代谢活性异质性强，且功能强弱与菌群丰度、可培养性无明显关联；传统长期富集培养会优先筛选生长快速的优势菌，大量慢速生长的关键功能菌丢失，平板分离手段通量低、筛选效率差，宏基因组、宏转录组等非培养组学仅能在群落层面预判功能潜力，无法分离得到活体活性菌株，而拉曼流式分选、同位素探针分选等单细胞技术又存在设备门槛高、流程繁琐等局限；以环丙沙星为代表的氟喹诺酮类抗生素在水体、底泥中广泛残留、难降解，仅依靠极少数微生物完成转化，现有手段难以捕获这类稀有功能菌，同时荧光 D - 氨基酸 HADA 可特异性标记正在合成细胞壁、具备代谢活性的活菌，因此亟需搭建一套依托 HADA 标记、结合流式分选的活性导向单细胞筛选方法，填补现有技术从功能潜力到活体功能菌分离的空白。
本研究构建了一套基于活性导向的 HADA-FACS 技术体系，可从复杂环境微生物组中分离代谢活性微生物。借助该方法，本研究在实验室筛选条件下富集并分离出一株此前被忽略的环丙沙星转化菌株 —— 潘多拉菌 AYGW-1。代谢产物图谱与多组学分析结果为该菌株转化环丙沙星、以及菌株转运、胁迫适应、氧化还原相关应答机制提供了佐证。从更广层面来看，HADA-FACS 技术操作简便、兼容传统培养手段，可用于从复杂微生物群落中获取稀有功能微生物；若搭配对应的选择性胁迫条件，该技术同样适用于其他类型污染物降解菌的挖掘。未来可将其与代谢组分析、多组学检测、其他活性表征技术联用，进一步拓展该方法的应用价值。
底泥微生物仅经环丙沙星短期驯化只能实现较低抗生素去除效果，无法富集功能菌；三组对照流式结果互相印证，无标记组无本底荧光、灭活菌荧光信号随时间大幅衰减、富碳阳性组活性细胞持续增多，证明 HADA 荧光仅由活菌代谢产生；环丙沙星胁迫下菌群中 HADA 阳性活性细胞占比随培养天数逐步上升，通过合理设置门控阈值将假阳性率控制在 0.5% 以内，整套 HADA 标记与流式分选门控体系可靠，可精准筛选抗生素胁迫下的代谢活性细菌。
图1. 环丙沙星胁迫条件下基于活性导向的 HADA 标记及分选门控验证结果。
(A) HADA-FACS 技术流程示意图，展示如何分离环丙沙星暴露下具有代谢活性的细菌；
(B) 驯化过程中底泥微生物群落对环丙沙星的转化效果；
(C~E) 无 HADA 未标记对照组培养第 1、3、5 天的流式图谱；
(F~H) 高温灭活阴性对照组培养第 1、3、5 天的流式图谱；
(I~K) 添加乙酸、不含环丙沙星的代谢活性阳性对照组培养第 1、3、5 天的流式图谱；
(L~N) 经环丙沙星处理的实验组菌群进行 HADA 标记后，培养第 1、3、5 天的流式图谱。
分选后流式重分析证明分选纯度极高，HADA 阳性菌群环丙沙星转化能力显著优于原始菌群与阴性菌群；分选后群落结构发生明显改变，潘多拉菌属成为优势类群；从阳性菌群分离得到四株可培养菌株，其中潘多拉菌 AYGW-1 转化环丙沙星效果最优，电镜可见该菌株为杆状，16S rRNA 系统发育分析确定其近缘分类地位。
图2. HADA - 荧光流式分选富集菌群的分选后验证结果
（A）分选所得 HADA 阳性菌群的流式复检结果；
（B）分选所得 HADA 阴性菌群的流式复检结果；
（C）分选前原始菌群、分选后 HADA 阳性菌群、HADA 阴性菌群的环丙沙星转化能力对比；
（D）HADA - 荧光流式分选前后细菌群落组成变化；
（E～H）四株代表性分离菌株的环丙沙星转化曲线，依次为副伯克霍尔德菌、寡养单胞菌、芽孢杆菌、潘多拉菌；
（I）潘多拉菌 AYGW-1 的扫描电镜图像；
（J）基于 16S rRNA 基因序列分析得到的潘多拉菌 AYGW-1 系统发育地位。
菌株最适生长条件为 30 ℃、中性 pH；葡萄糖对菌株生长提升有限，乙酸更利于菌体增殖。无外源碳时菌株仍可转化环丙沙星，补充乙酸能显著提升转化效率，葡萄糖作用微弱；酸性、强碱性环境会明显抑制转化能力，环丙沙星初始浓度变化也会改变整体转化效果。
图3. 潘多拉菌 AYGW-1 的生理响应及环丙沙星转化特性。
(A～D) 温度 (A)、pH (B)、碳源条件（葡萄糖 (C)、乙酸 (D)）对该菌株生长状况的影响；
(E～H) 环丙沙星初始浓度 (E)、葡萄糖投加量 (F)、乙酸投加量 (G)、pH (H) 对环丙沙星转化效率的影响。
基于超高效液相色谱 - 质谱检测到 9 种环丙沙星转化中间产物，据此推导菌株存在两条并行转化路径：一是对环丙沙星哌嗪环进行氧化、开环与侧链裂解修饰，二是对喹啉母核发生脱氟及后续结构改造，证明该菌株可通过多靶点同步修饰环丙沙星分子，并非单一线性转化过程。
图4. 基于超高效液相色谱 - 质谱检出中间产物推导得到的环丙沙星推测转化路径
潘多拉菌 AYGW-1 的完整基因组环形图谱直观呈现该菌株基因组整体骨架结构，基于 COG 数据库的基因功能分类结果显示菌株编码基因大量富集于氨基酸转运代谢、能量产生、信号传导与膜转运相关功能类别；KEGG 通路注释进一步注释出多条碳水代谢、外源污染物降解、氧化还原反应及环境胁迫响应相关通路，从基因组层面阐明该菌株具备降解环丙沙星、适应抗生素胁迫环境的遗传基础。
图 5 潘多拉菌 AYGW-1 菌株的基因组特征
(A) 完整基因组环形图谱；
(B) 基于 COG 数据库对预测基因的功能分类；
(C) 基于 KEGG 通路的基因功能注释。
转录组分析差异基因火山图直观区分出大量显著上调与下调基因，说明抗生素胁迫下菌株整体转录谱发生明显重塑；GO 功能注释从生物过程、细胞组分、分子功能三个维度显示差异基因显著富集于氧化还原、跨膜转运、环境胁迫应答与外源物质代谢相关条目；KEGG 通路富集分析进一步富集到多条能量代谢、药物降解、氧化应激及物质转运通路，完整揭示菌株应对环丙沙星毒性时，通过调控氧化还原、膜转运、胁迫适应等相关基因的转录水平，协同完成抗生素转化与环境耐受的分子响应机制。
图6. 潘多拉菌 AYGW-1 在环丙沙星胁迫下的转录响应
(A) 差异表达基因的火山图；
(B、C) 该菌株转录组的基因本体（GO）功能注释；
(D、E) 转录组的 KEGG 通路富集分析。
图7. 结合代谢产物特征与转录组响应推导得出的环丙沙星协同转化途径示意图