成功案例 | 从药效到机制：借助scRNA-seq与单细胞免疫组库，深度解析circRNA新抗原疫苗如何逆转抑制性肿瘤微环境
文章标题：A circRNA neoantigen vaccine elicits potent antitumor immunity and synergizes with checkpoint blockade in melanoma
文章主题：环状RNA新抗原疫苗可激发强效抗肿瘤免疫反应，并与黑色素瘤中的检查点阻断疗法产生协同效应
发表期刊：Cancer Letters
影响因子：10.1
组学技术：单细胞转录组测序、单细胞TCR测序
当前肿瘤免疫治疗主流手段如免疫检查点阻断、过继细胞疗法存在应答率有限、耐药、实体瘤免疫浸润不足等短板，肿瘤自身低免疫原性与复杂免疫抑制微环境是关键瓶颈；肿瘤新抗原因肿瘤特异性强、免疫原性高成为理想免疫治疗靶点，肽、DNA、线性mRNA新抗原疫苗各有缺陷，而共价闭合环状结构的circRNA稳定性更强、可稳定翻译抗原且兼具佐剂活性，是新一代RNA疫苗优质载体，但现有circRNA新抗原疫苗对肿瘤微环境重塑的完整机制尚不清晰，且联合免疫治疗策略有待系统验证，黑色素瘤突变负荷高，是评估新抗原疫苗的经典模型，基于此本研究开展多新抗原circRNA黑色素瘤疫苗相关探究。
图1. 分析流程图
1. circRNAᴹᴺᴬ疫苗可显著抑制小鼠体内肿瘤生长
构建circRNA的新抗原疫苗后，为验证LNP-circRNA疫苗的体内抗肿瘤活性，作者分别在预防性、治疗性荷瘤小鼠模型中评估药效，发现circRNA疫苗（尤其是多表位circRNAᴹᴺᴬ）可通过诱导强效抗原特异性T细胞应答有效抑制肿瘤进展。
图2. 新抗原环状RNA疫苗在预防性和治疗性小鼠模型中显著抑制肿瘤生长
2. 黑色素瘤微环境的单细胞转录组图谱绘制
为进一步解析circRNA疫苗的抗肿瘤功效与分子机制，作者对circRNAᴹᴺᴬ处理组与对照组小鼠黑色素瘤组织开展单细胞RNA测序，在单细胞分辨率下解析肿瘤与免疫转录组景观。共鉴定出黑色素瘤细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、NK细胞、B细胞、树突状细胞、中性粒细胞、成纤维细胞等主要细胞类群，各类细胞均有特征标记基因。circRNAᴹᴺᴬ组与对照组的肿瘤微环境细胞构成存在显著差异；黑色素瘤细胞占比最高，转录本拷贝数与拷贝数变异（CNV）水平最高，符合恶性细胞特征；单核/巨噬细胞、T细胞是两组肿瘤中最主要的免疫浸润细胞。
将黑色素瘤细胞单独降维聚类，得到3个转录、功能特征完全不同的亚群。circRNAᴹᴺᴬ疫苗处理后Ccl6⁺ Mel细胞几乎被完全清除；该亚群高表达趋化因子与MHC分子，富集趋化因子信号、白细胞招募、抗原加工递呈、免疫应答相关通路，是易被清除的肿瘤细胞亚群。与之相反，Cdk1⁺ Mel 细胞高表达 Ccna2、Cdk1，与细胞周期、分裂、DNA 复制通路相关；Cdhr4⁺ Mel 细胞富集迁移、Wnt 信号通路。
上述结果说明 Ccl6⁺ Mel 具备高免疫原性，更易被免疫系统清除；Cdk1⁺ Mel、Cdhr4⁺ Mel 可依靠增殖、代谢重塑实现免疫逃逸，这也解释了疫苗处理后 Ccl6⁺ Mel 被选择性清除的分子机制。
图3. 单细胞分辨率下黑色素瘤细胞的转录组图谱
3. circRNAᴹᴺᴬ疫苗重塑瘤内单核/巨噬细胞异质性
单核/巨噬细胞是肿瘤微环境中核心免疫组分，circRNAᴹᴺᴬ疫苗可显著提升该类细胞的瘤内浸润水平。基于UMAP聚类将单核/巨噬细胞分为6个亚群：Mono-Cd14、Mono-Vcan、Mono-Itgal、Macro-Spp1、Macro-C1qc、Macro-Ifng；各亚群细胞占比、转录特征存在明显差异，功能分化各不相同。
circRNAᴹᴺᴬ疫苗显著扩增具有抗肿瘤表型的亚群：Mono-Vcan、Macro-C1qc、Macro-Ifng，同时减少免疫抑制型Macro-Spp1的占比，说明疫苗通过重塑单核/巨噬细胞组成激活抗肿瘤免疫。Mono-Vcan为经典炎症单核细胞，Macro-Spp1、Macro-C1qc分别对应已知肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的促瘤、抑瘤经典表型；Macro-Ifng 与经典活化M1型巨噬细胞特征高度匹配，高表达MHC II分子与Ifng，抗原加工递呈评分仅次于Macro-C1qc。
CellChat细胞通讯分析显示，circRNAᴹᴺᴬ疫苗组肿瘤内细胞互作数量、互作强度均显著高于对照组；黑色素瘤细胞与单核/巨噬细胞间配体-受体互作分析显示，Ccl6⁺Mel亚群与单核/巨噬细胞间趋化信号显著富集，可促进单核/巨噬细胞招募并清除肿瘤细胞，而Cdk1⁺Mel、Cdhr4⁺Mel与髓系细胞几乎无有效通讯；所有单核/巨噬亚群中，Mono-Vcan可被最多种类趋化因子招募。
RNA速率分析显示细胞分化流向：单核细胞（Mono-Cd14、Mono-Vcan、Mono-Itgal）定向分化为不同巨噬细胞亚群（Macro-Spp1、Macro-C1qc、Macro-Ifng）。炎症单核细胞扩增通常对应免疫活跃肿瘤微环境，伴随干扰素信号增强、抗原递呈提升、T细胞活化，推动TAM向M 极化。本研究中Mono-Vcan、Macro-Ifng均富集干扰素通路，高表达干扰素诱导标记Ly6a，ISG 特征评分最高。结合RNA速率结果可知，Mono-Vcan扩增可促进其向具备抑瘤功能的 Macro-Ifng 分化，建立免疫活跃微环境。
综上，circRNAᴹᴺᴬ疫苗可重编程瘤内髓系免疫网络：招募炎症单核细胞，诱导其获得干扰素活化特征，并动态分化为高抗原递呈、杀伤肿瘤的巨噬细胞，全面提升抗肿瘤免疫。
图4. 不同单核/巨噬细胞亚群的功能特征与进化轨迹
4. circRNAᴹᴺᴬ疫苗增强T/NK细胞介导的抗肿瘤免疫
T、NK各亚群在circRNAᴹᴺᴬ组与对照组中占比差异显著；circRNAᴹᴺᴬ疫苗显著降低初始T细胞比例，符合抗原驱动T细胞活化分化特征。单细胞TCR测序结果显示，疫苗组T细胞整体克隆型多样性更高，CD4 Eff、CD8 Cyto亚群克隆型大幅扩增。上述结果证实circRNAᴹᴺᴬ疫苗可驱动抗原特异性T细胞活化、克隆扩增与效应分化，诱导强效适应性免疫。
CD4 Eff 细胞占比在疫苗组显著升高。细胞通讯分析显示CD4 Eff细胞高度富集抗原加工递呈相关信号通路，其中Macro-Ifng的抗原递呈活性最强。该结果与现有研究一致：MHC II限制性CD4⁺T细胞可主导抗肿瘤应答，直接发挥细胞毒性，同时调控髓系细胞功能，说明circRNAᴹᴺᴬ疫苗通过增强抗原递呈信号促进CD4 Eff活化扩增，介导肿瘤清除。
与对照组相比，circRNAᴹᴺᴬ疫苗显著提升NK细胞瘤内浸润；细胞通讯分析显示单核/巨噬细胞与NK细胞间富集Ccl4/Ccl3-Ccr5、Ccl7/Ccl6-Ccr2 等迁移相关互作，黑色素瘤细胞与NK细胞间无直接趋化信号，这类趋化互作可促进NK细胞募集、增强抗肿瘤活性。
但circRNAᴹᴺᴬ疫苗同时升高耗竭CD8 Tex细胞比例，该亚群高表达耗竭相关基因，限制肿瘤完全清除。作者检测多种临床相关免疫检查点分子，发现TIGIT在CD8 Tex中表达最高，NK细胞中表达同样上调。多重免疫荧光染色证实，与对照组相比，circRNAᴹᴺᴬ组CD8⁺TIGIT⁺耗竭T细胞与SOX10⁺NECTIN2⁺肿瘤细胞在空间上紧密相邻；虽然也检测到Lgals9-Havcr2互作，但Havcr2整体表达水平较低。
以上结果提示：联合靶向TIGIT的免疫检查点阻断疗法，可进一步提升circRNAᴹᴺᴬ疫苗的抗肿瘤疗效。
图5. T/ NK 细胞的单细胞聚类分析
5. circRNAᴹᴺᴬ疫苗联合免疫检查点阻断协同抑制小鼠肿瘤生长
临床患者常存在高肿瘤负荷，肿瘤可通过多重机制实现免疫逃逸，联合治疗是实现持久肿瘤控制的关键。T/NK单细胞组学结果提示靶向TIGIT可提升疫苗疗效，且TIGIT抑制剂与PD1抑制剂联用可进一步放大抗肿瘤效应。因此作者设置6组处理方案。免疫流程遵循治疗性肿瘤模型设置。结果显示，相较于单疫苗、单检查点抑制剂，circRNAᴹᴺᴬ联合抗TIGIT、或联合抗TIGIT+抗PD1均可显著增强肿瘤抑制效果，其中三联组合抑瘤作用最强。流式检测证实，相较单独疫苗，联合治疗组肿瘤内CD4⁺、CD8⁺效应T细胞比例更高，IFN-γ、TNF-α分泌量更多；ELISA检测显示疫苗可升高全身IFN-γ、TNF-α水平，联合治疗组细胞因子进一步上调。各组脏器H&E染色均未见明显组织毒性，联合治疗未增加额外安全风险。
图6. 在小鼠中联合使用circRNA疫苗接种与免疫检查点疗法可产生协同肿瘤抑制效应
本研究成功构建了LNP包裹的多新抗原circRNA肿瘤疫苗，在黑色素瘤小鼠模型中证实其能够诱导强烈的T细胞依赖性抗肿瘤免疫；研究利用单细胞转录组联合单细胞TCR测序等组学技术，在单细胞水平系统解析了疫苗重塑肿瘤微环境的完整机制，阐明疫苗一方面清除高免疫原性肿瘤细胞亚群，另一方面推动单核巨噬细胞向M1型抗肿瘤表型极化，促进CD4⁺效应T细胞扩增与CD8⁺T 细胞克隆增殖，同时发现CD8⁺耗竭T细胞高表达TIGIT是免疫逃逸的关键节点；后续动物实验进一步证实circRNA疫苗与抗TIGIT、抗PD1免疫检查点阻断方案联用具备显著协同抗肿瘤效果。该研究不仅完善了circRNA新抗原疫苗的免疫调控理论，也为基于单细胞多组学筛选联合治疗靶点、开发实体瘤个性化RNA免疫治疗新策略提供了坚实的实验依据。